雌性化及び雄性化指標遺伝子のクローニングとその発現蛋白に対する特異的抗体の作製

克隆女性化和男性化指示基因并生产针对其表达蛋白的特异性抗体

• 批准号: 14042257
• 负责人: 星 英之
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14042257/
• 关键词: 野生生物; モレキュラークローニング; 内分泌攪乱; vitellogenin; DMRT1; タンパク発現; RT-PCR; バイオモニタリング; バイオマーカー; 鳥類; は虫類; ビテロジェニン; VMO-1; クローニング

昨年に引き続き、クサガメ(Chimemys reevesii)及びカワウ(Phalacrocorax carbo)の雌性指標遺伝子vitel-logenin(VTG)のクローニングを行った。その結果、クサガメから、743アミノ酸をコードする2,229bpのVTG cDNA断片(CRVTG)、カワウから371アミノ酸をコードする1,253bpのVTG cDNA断片(PcVg3')のクローニング及び塩基配列の決定に成功した。決定された塩基配列を元にクサガメ及びカワウのVTGに特異的なプライマーを作製し、半定量的なRT-PCRにより以下の2点を検討した。1)幼若クサガメ4個体に対し、500μg/kg B.W.の17β-estradiol (E_2)を体腔内に単回投与し、投与前、投与後6、12,24,48時間目および5、8、16日目に採血および肝臓部分切除術を行い、RT-PCRにより肝臓でのVTG mRNAを、クサガメVTG mAbを用いたウェスタンブロッティングにより血清中VTGの発現量を解析した。その結果、E_2を投与した6時間後には、投与前と比較して有意にVTG mRNAが誘導され、24時間後には最大の発現を示した。その後、VTG mRNAの発現は、48時間後から緩やかな減少傾向を示し、投与の8日後には、投与前の発現量まで減少した。一方、血清中VTGタンパクの発現は、E_2投与後8日目に有意な増加を示した。この事から、VTG mRNAはE_2曝露が最近あったことの指標として有効であることが示された。2)三重県から、繁殖期に当たる、4月下旬に捕獲したカワウ(オス7個体、メス5個体)について、β-actin mRNAを内部標準とした、VTG mRNAの半定量的RT-PCRを行った。その結果、本来、発現がほとんど認められないと予想されるオスでも、VTG mRNAの発現が認められた。さらに、驚くべき事に、VTG mRNAの発現の雌雄差をt-検定により解析したところ、P<0.05を有意とした場合、雌雄差は認められなかった。このことから、カワウのオスに雌性化が起こっていることが示唆された。さらに、クサガメのDMRT1及びカワウのVTGについては、pGEX4T2ベクター及びBL21(DE3)によるタンパク発現を試み、それぞれのタンパクの発現が確認された。現在、抗体作成に向けて、タンパクの精製を行っている。

Last year, the female index gene vitel-logenin(VTG) of (Chimemys reevesii) and (Phalacrocorax carbo) was released. As a result, the identification and alignment of VTG cDNA fragment (CRVTG) of 2,229 bp and VTG cDNA fragment (PcVg3') of 1,253 bp were successfully determined. The following two points were discussed in order to determine the nucleotide sequence of VTG. 1)17β-estradiol (E_2) was isolated from 4 young individuals at 6, 12, 24, and 48 days after administration of 500μg/kg B.W. and analyzed for VTG mRNA and mAb expression in serum by RT-PCR. The results showed that VTG mRNA was induced 6 hours after E_2 injection, and the maximum expression was observed 24 hours after E_2 injection. The expression of VTG mRNA decreased after 48 days and decreased after 8 days. VTG levels in serum increased 8 days after administration of E_2. VTG mRNA is the most recent indicator. 2)Triplex PCR was performed at the beginning of reproductive period, at the end of April, at the end of reproductive period, at the end of reproductive period. VTG mRNA expression is recognized by the expression of VTG mRNA. The difference between male and female expression of VTG mRNA was analyzed when P<0.05. This is the first time I've ever seen a woman who's been feminized. In addition, DMRT1 and VTG of DMRT1 and DMRT1 are tested for detection of DMRT1 and VTG of DMRT1. Now, antibody production process, purification process.

项目成果

H.Hoshi, Y.Kamata, T.Uemura: "Effects of 17β-Estradiol, Bisphenol A and Tributyltin Chloride on Germ Cells of Caenorhabditis elegans"The Journal of Veterinary Medical Science. (in press). (2003)

H.Hoshi、Y.Kamata、T.Uemura：“17β-雌二醇、双酚 A 和三丁基氯化锡对秀丽隐杆线虫生殖细胞的影响”《兽医医学科学杂志》（2003 年）。

Hoshi, H., Kamata, Y., Uemura, T.: "Effects of 17β-estradiol, bisphenol A and tributyltin chloride on germ cells of Caenorhabditis elegans"J.Vet.Med.Sci.. 65(8). 881-885 (2003)

Hoshi, H.、Kamata, Y.、Uemura, T.：“17β-雌二醇、双酚 A 和三丁基氯化锡对秀丽隐杆线虫生殖细胞的影响”J.Vet.Med.Sci. 65(8)-。 885（2003）

Tada, N., Saka, M., Ueda, Y., Hoshi, H., Uemura, T., Kamata, Y.: "Comparative analyses of serum vitellogenin levels in male and female Reeves' pond turtles (Chinemys reevesii) by an immunological assay."J.Comp.Physiol. [B].. 174(1). 13-20 (2004)

Tada, N.、Saka, M.、Ueda, Y.、Hoshi, H.、Uemura, T.、Kamata, Y.：“雄性和雌性里氏池龟（Chinemys reevesii）血清卵黄蛋白原水平的比较分析