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ヒトプレB細胞よりBLM破壊株の作製とその非相同組換え能の解析

从人前 B 细胞中产生 BLM 破坏的菌株并分析其非同源重组能力

基本信息

批准号：
16021247
负责人：
小山秀機
金额：
$ 3.26万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

高発がん性遺伝病ブルーム症候群は、高頻度の姉妹染色体交換とともに欠失、転座などの染色体異常を示す。この異常の原因となり発がんにつながる可能性のあるエラープローンの非相同的末端連結(NHEJ)の解析は、わずかである。我々はヒトプレB細胞腫由来Nalm-6株およびNHEJに必須のDNAリガーゼIV(Lig4)欠損株から、ジーンターゲティングによりBLM破壊株と2重破壊株を取得し、性状解析を行った。また、4株のHPRT座へSceI部位を導入した株を作製し、ついでSceI発現ベクターを導入・誘発した2重鎖切断(DSB)のNHEJによる修復能を解析した。その結果、BLM破壊株は野生株に比べて増殖遅延や1本鎖切断を生じるMMSやUVに対する高感受性、突然変異率の上昇などの表現型を示したが、興味深いことに、これら表現型はLig4欠損との2重破壊株では抑制された。これはBLM破壊株において、DNA複製の際に1本鎖切断からone-ended DSBを多数生じ、NHEJ修復による異常な組換えにより細胞死を起こすためと考える。一方、染色体SceI部位に誘導したtwo-ended DSBのNHEJ修復において、BLM破壊株は野生株とほぼ同じ修復パターンを示した。この結果から、ブルーム細胞においてone-ended DSBのNHEJ修復が、染色体異常を引き起こす原因であることが示唆される。一方、NHEJの主要因子KU70の破壊株作製のため、野生株をターゲティングしてヘテロ破壊株を得たがホモ破壊株が得られず、KU70は増殖・生存に必須と考える。そこでTet制御系を用いた条件致死株の作製を試み、ヘテロ破壊株にTet制御ベクターを導入した。ついでTet応答性ヒトKU70 cDNAベクターを導入し、DOXで制御できる株を分離した。この株を用いてKU70遺伝子のターゲティングを行った。

High frequency of chromosome exchange, deletion, and chromosome abnormality The reason for this anomaly is the possibility of analyzing non-identical terminal links (NHEJ). The origin of B cell tumor was Nalm-6 strain and NHEJ strain. The necessary DNA fragment IV(Lig4) was obtained from Nalm-6 strain and NHEJ strain. The repair ability of NHEJ in HPRT site of 4 plants was analyzed. As a result, BLM strains are resistant to high susceptibility, high mutation rate, and low mutation rate compared to wild strains. This is the first time that BLM has broken down, DNA replication has broken down, one-ended DSB has broken down, NHEJ has broken down, and cell death has broken down. A chromosome SceI site is induced in two DSB and NHEJ repair sites, and BLM is induced in two wild DSB and NHEJ repair sites The results showed that the NHEJ repair of DSB was caused by chromosome abnormality. The main factor of KU70 in NHEJ is the growth and survival of wild plants. The Tet control system is used to test the effect of Tet control on plant growth. KU70 cDNA was introduced and isolated. This plant is used in the production of KU70.