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ヒト遺伝子の系統的な機能解析に向けた高効率ジーンターゲティング系の開発

开发高效的基因打靶系统，用于人类基因的系统功能分析

基本信息

批准号：
16012252
负责人：
小山秀機
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト細胞からジーンターゲティングによりノックアウト株の作製は、ターゲット効率低く困難である。最近、我々はヒトプレB細胞腫由来のNalm-6株が高いターゲット効率を持つことを見出した。そこで本研究はヒト遺伝子の系統的な機能解析に応用するため、Nalm-6株を用いた高効率ターゲティング系を開発することを目的とする。今年度、常染色体遺伝子変異・有糸分裂組換え系を作製と、増殖必須遺伝子の条件致死変異株の作製を行った。その結果、(1)10種類の遺伝子座のターゲティングを行い、2〜10%の高効率でターゲットクローンを得た。したがって、Nalm-6細胞が高効率のターゲティングが可能な株であることを確認した。(2)16番染色体に座乗するAPRT遺伝子のターゲティングを行い、ヘテロ破壊(APRT+/-)株を得た。この株を用いて、8-アザアデニン耐性でホモ破壊(APRT-/-)細胞の自然突然変異を検出するFluctuation test系をほぼ作製した。(3)変異遺伝子の構造解析のため、APRT遺伝子領域を増幅できるPCR解析系を作製した。また、APRT座にリンクし相同染色体を識別できるミニサテライトマーカーを見出した。(4)一方、DNAの2重鎖切断修復やテロメア維持に働くKU70遺伝子の欠損株を取得するためターゲティングを行い、ヘテロ変異株を得た。ついで、第2のターゲティングを行ったがホモ変異株が得られず、KU70は増殖・生存に必須と思われた。(5)そこで、Tet制御系を用いて条件致死株として分離するため、まずヘテロ変異株にTetベクターを導入した。ついで、Tet応答性ヒトKU70 cDNAベクターを導入し、DOXで発現制御できる株を分離した。この株にKU70ターゲティングを行ったがターゲットクローンを得られず、さらに分離法を検討している。

It is difficult to control the growth of the plant. Recently, Nalm-6 strain was found to have high B cell proliferation rate. This study aims to analyze the function of the gene system and develop the gene system with high efficiency. This year, autosomal DNA mutations have been identified, and genetic mutations have been identified. The results are as follows: (1)10 kinds of genetic loci are selected from the list of genetic loci, and 2 ~ 10% of genetic loci are selected from the list of genetic loci. Nalm-6 cells have been identified as having a high rate of infection. (2)16 The chromosome locus of the APRT gene is located in the middle of the line, and the APRT+/-strain is obtained. The Fluctuation test system for the detection of natural abrupt changes in APRT-/-cells was developed. (3)The PCR analysis system was developed in the domain of differential gene analysis and APRT gene analysis The same chromosome is identified at the APRT locus. (4)One side, DNA 2-fold lock repair, maintenance, KU70 gene damage, plant acquisition, plant repair, plant repair In the middle of the second year, the third year, the fourth year, the fourth year, the fourth (5)The plant was isolated from the plant under the control of Tet. KU70 cDNA was introduced into the genome and isolated from the genome. This plant KU70 has been divided into three parts: