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ヒト遺伝子の系統的な機能解析に向けた高効率ジーンターゲティング系の開発

开发高效的基因打靶系统，用于人类基因的系统功能分析

基本信息

批准号：
16012252
负责人：
小山秀機
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト細胞からジーンターゲティングによりノックアウト株の作製は、ターゲット効率低く困難である。最近、我々はヒトプレB細胞腫由来のNalm-6株が高いターゲット効率を持つことを見出した。そこで本研究はヒト遺伝子の系統的な機能解析に応用するため、Nalm-6株を用いた高効率ターゲティング系を開発することを目的とする。今年度、常染色体遺伝子変異・有糸分裂組換え系を作製と、増殖必須遺伝子の条件致死変異株の作製を行った。その結果、(1)10種類の遺伝子座のターゲティングを行い、2〜10%の高効率でターゲットクローンを得た。したがって、Nalm-6細胞が高効率のターゲティングが可能な株であることを確認した。(2)16番染色体に座乗するAPRT遺伝子のターゲティングを行い、ヘテロ破壊(APRT+/-)株を得た。この株を用いて、8-アザアデニン耐性でホモ破壊(APRT-/-)細胞の自然突然変異を検出するFluctuation test系をほぼ作製した。(3)変異遺伝子の構造解析のため、APRT遺伝子領域を増幅できるPCR解析系を作製した。また、APRT座にリンクし相同染色体を識別できるミニサテライトマーカーを見出した。(4)一方、DNAの2重鎖切断修復やテロメア維持に働くKU70遺伝子の欠損株を取得するためターゲティングを行い、ヘテロ変異株を得た。ついで、第2のターゲティングを行ったがホモ変異株が得られず、KU70は増殖・生存に必須と思われた。(5)そこで、Tet制御系を用いて条件致死株として分離するため、まずヘテロ変異株にTetベクターを導入した。ついで、Tet応答性ヒトKU70 cDNAベクターを導入し、DOXで発現制御できる株を分離した。この株にKU70ターゲティングを行ったがターゲットクローンを得られず、さらに分離法を検討している。

ヒトCell からジーンターゲティングによりノックアウト strain の manufacturing は, ターゲット inefficiency and difficulty である. Recently, I have developed a high-efficiency Nalm-6 strain of B-cell tumours.そこでThis study is a functional analysis of the はヒト伝子の system. するため、Nal m-6 strains are used for high-efficiency high-efficiency sterilization systems. This year, autosomal genetic mutations and cleavage replacement are necessary for reproduction, and the conditions for reproduction must be the lethality of genetic mutations.その results, (1) 10 kinds of の伝子杼のターゲティングを行い, 2~10% high efficiency でターゲットクローンを得た.したがって、Nalm-6 cells がHigh efficiency のターゲティングがpossible な strain であることをconfirmed した. (2) Chromosome 16 is produced by the APRT legacy のターゲティングを行い and APRT+/- strains. This product is produced by the Fluctuation test system of このをいて and 8-アザアデニン tolerant でホモ棊 (APRT-/-) cells. (3) Structural analysis of divergent genes and the PCR analysis system of the APRT genetic material field have been expanded.また、APRTにリンクしidentification of the same chromosome できるミニサテライトマーカーを见出した. (4) One side, DNA's 2 double lock cutting and repairing やテロメアmaintenance KU70 legacy The son's missing strain is the same as the するためターゲティングを行い, and the ヘテロ変different strain is obtained.ついで, 2nd のターゲティングを行ったがホモ変different strain が got られず, KU70 はproliferation・survival に必と思われた. (5) The control system of Tet and Tet are separated by the conditional lethal strain of Tet, and the different strains of Tet are separated and imported.ついで, Tet-responsive KU70 cDNA was imported, and DOX was now controlled and the KU70 cDNA was isolated. KU70ターゲティングを行ったがターゲットクローンを got られず, さらに separation method を検多している.