ヒト遺伝子の系統的な機能解析に向けた高効率ジーンターゲティング系の開発

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ヒト細胞からジーンターゲティングによりノックアウト株の作製は、ターゲット効率低く困難である。最近、我々はヒトプレB細胞腫由来のNalm-6株が高いターゲット効率を持つことを見出した。そこで本研究はヒト遺伝子の系統的な機能解析に応用するため、Nalm-6株を用いた高効率ターゲティング系を開発することを目的とする。今年度、常染色体遺伝子変異・有糸分裂組換え系を作製と、増殖必須遺伝子の条件致死変異株の作製を行った。その結果、(1)10種類の遺伝子座のターゲティングを行い、2〜10%の高効率でターゲットクローンを得た。したがって、Nalm-6細胞が高効率のターゲティングが可能な株であることを確認した。(2)16番染色体に座乗するAPRT遺伝子のターゲティングを行い、ヘテロ破壊(APRT+/-)株を得た。この株を用いて、8-アザアデニン耐性でホモ破壊(APRT-/-)細胞の自然突然変異を検出するFluctuation test系をほぼ作製した。(3)変異遺伝子の構造解析のため、APRT遺伝子領域を増幅できるPCR解析系を作製した。また、APRT座にリンクし相同染色体を識別できるミニサテライトマーカーを見出した。(4)一方、DNAの2重鎖切断修復やテロメア維持に働くKU70遺伝子の欠損株を取得するためターゲティングを行い、ヘテロ変異株を得た。ついで、第2のターゲティングを行ったがホモ変異株が得られず、KU70は増殖・生存に必須と思われた。(5)そこで、Tet制御系を用いて条件致死株として分離するため、まずヘテロ変異株にTetベクターを導入した。ついで、Tet応答性ヒトKU70 cDNAベクターを導入し、DOXで発現制御できる株を分離した。この株にKU70ターゲティングを行ったがターゲットクローンを得られず、さらに分離法を検討している。