生殖細胞-セルトリ細胞共培養を用いた精原細胞増殖因子と分化因子の単離・同定

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本研究では、最近樹立されたゼブラフィッシュセルトリ細胞株からセルトリ細胞に由来する精子形成調節因子の単離を試みた。すでに、精原細胞の増殖を促進させるZtA6-2株と精子への分化を促進させるZtA6-12株が単離できているため、これら2株に対して、約2万種類のゼブラフィッシュ遺伝子オリゴDNAをプロットしたマイクロアレイによる解析を進めた。また前年度の研究で、パラフィン包埋による精巣組織切片in situハイブリダイゼーションでは多くのクローンのシグナルを検出できないことがわかったため、凍結切片法の確立を行なった。マイクロアレイ解析により、ZtA6-12株に対してZtA6-2株で3倍以上発現差のあるものとして45遺伝子、ZtA6-2株に対してZtA6-12株で156遺伝子を見出すことができた。ZtA6-12株からはステロイドホルモンの代謝酵素や受容体に関係する遺伝子が数多く見出されており、興味深い。昨年度、cDNAサブトラクション実験により、ZtA6-12株に対してZtA6-2株で強く発現しているものとして205クローン、その逆で256クローンが単離できているため、現在共通に認められる遺伝子を選択中である。また、凍結切片を進めたところ、パラフィン切片とそれほど遜色なく、魚類精巣の特徴であるセルトリ細胞が生殖細胞を取り囲むシスト構造を維持しており、市販抗体との反応性も高いことがわかった。現在、精母細胞特異的抗体との反応性を調べるとともに、セルトリ細胞株特異的な遺伝子の発現部位をin situハイブリダイゼーションにより解析中である。さらに、セルトリ細胞株のスクリーニングによりZtA6-6株がA型精原細胞を約1ヶ月間維持することがわかった。今後はこの株もマイクロアレイ解析を進め、3種の株を用いて特異的遺伝子を解析して行く予定である。