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ニジマス卵巣のNADPH-チトクロームP450還元酵素とチトクロームb5

虹鳟鱼卵巢中的 NADPH-细胞色素 P450 还原酶和细胞色素 b5

基本信息

批准号：
05740498
负责人：
酒井則良
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Fukui Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

サケ科魚の卵母細胞の最終成熟は卵濾胞組織で生成される17alpha,20beta-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン(17alpha,20beta-DHP)により誘起されるが、この卵成熟誘起ホルモンの生成には卵濾胞莢膜細胞層での前駆体17alphaヒドロキシプロゲステロン(17alpha-HP)の生成が必要である。本研究では、莢膜細胞での17alpha-HP生成の分子機構を解析することを目的として、ステロイド代謝酵素チトクロームP450c17(17alphaヒドロキシラーゼ/C17-20リアーゼ)の活性に影響を与えると考えられるNADPH-チトクロームP450還元酵素あるいはチトクロームb_5のcDNAをクローニングを行った。ニジマス莢膜細胞のcDNAライブラリーをラットのチトクロームb_5cDNAをプローブとしてスクリーニングした結果、1.5X10^5プラークから7個のポジティブクローンが得られた。現在その中の一つの塩基配列を決定中である。また、NADPH-チトクロームP450還元酵素については、ニジマスのこの酵素は既に精製されておりアミノ酸配列が決定されているので、このアミノ酸配列から予想される塩基配列を持つ合成ヌクレオチドを作成し、それをプローブに現在ニジマス莢膜細胞のcDNAライブラリーをスクリーニング中である。得られたそれぞれのcDNAは塩基配列の決定後、発現用プラスミドに組み込みサルの細胞株COS-1細胞等で発現させて、その活性を調べることにより最終的な同定を行う予定である。既に得られているチトクロームP450c17 cDNAと本課題でのNADPH-チトクロームP450還元酵素とチトクロームb_5のcDNAを用いて莢膜細胞での17alpha-HP生成に果たすこれらの酵素の役割を明らかにして行きたいと考えている。

The formation of 17alpha,20 beta-DHP (17 alpha,20beta-DHP) precursor to the oocyte filter cell layer is essential for the formation of oocyte maturation in fish. The purpose of this study was to analyze the molecular mechanism of 17 alpha HP production in capsular cells and to investigate the effects of NADPH on the activity of P450c17(17alpha) metabolic enzyme and the cDNA of P450 catalytic enzyme. The cDNA of the membrane cell is divided into 7 parts: 1. 5X10^5, 2. 5X10^5, and 3. 5X10^5. Now we have to decide on the basis of the arrangement of the base. P450 enzyme is purified and acid alignment is determined. The nucleotide sequence of the P450 enzyme is synthesized and the cDNA sequence of the P450 capsular cell is determined. After determining the gene alignment of the cDNA sequence, the gene expression and activity modulation of the cDNA sequence were determined in COS-1 cells. The cDNA of NADPH-C-P450c17 and the cDNA of NADPH-C-P450c17 in this subject were obtained. The cDNA of NADPH-C-P450c17 and NADPH-C-P450c17 in capsular cells was used to produce 17 alpha HP.