生体における組織特異的選択的スプライシング制御機構の解明

阐明活体组织特异性选择性剪接控制机制

基本信息

批准号：
17017016
负责人：
黒柳秀人
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

線虫の相互排他的エクソンの発現をモニターするためのミニ・ジーンを作製した。このミニ・ジーンを普遍的発現プロモータで全身に発現させたところ、それぞれの組織はどちらかあるいは双方を発現していた。各種の組織特異的プロモータを用いて同じミニ・ジーンを発現させたところ、普遍的プロモータのときと同様、筋肉系はエクソン5A、神経系・上皮系はエクソン5Bという組織特異的エクソン選択性の違いが確認され、組織特異性を示すことが判明した。組織特異性を示すために必要なシス・エレメントを同定するために、エクソン領域の欠失や点変異の導入を行い、エクソン5B上の配列がエクソン5Bの選択に必要でないこと、一方イントロン4上のGCAUGを含む配列がエクソン5Aを選択するために必要であることが明らかとなり、このレポーター系によってシス・エレメントを探索できることが示された。組織特異性を制御するトランスの因子を探索するために、体壁筋特異的myo-3プロモータ制御下でエクソン5A-RFPを優勢に発現するレポーター線虫にEMSで突然変異を誘導し、GFPの発現が強まることを指標に、ワーム・ソーターを使用して、体壁筋におけるエクソン選択性が変化する変異体の単離を試みた。その結果、およそ5万ゲノムのスクリーニングにより約30株の独立の変異体が得られた。これらの変異体の表現型の分類、染色体マッピングおよび相補性試験の結果、少なくとも4つの遺伝子座が存在することが判明した。得られた変異体について、snip-SNPs法によるマッピングを進めて、これまでに3つの遺伝子座について遺伝子を同定した。うち1つは新規のRNA結合タンパク質をコードし、alternative-splicing-defective-1(asd-1)と命名した。asd-1が線虫の他の既知のRNA結合タンパク質の1つと高い配列相同性を有していることから、これらの二重変異体を作製したところ、体壁筋におけるレポーターの発現は完全にエクソン5B優位となることがわかった。また、これらのRNA結合タンパク質はイントロン4上に見出されたシス・エレメントに試験管内で特異的に結合することも確認された。さらに、二重変異体では、内在性の遺伝子のエクソン選択性もレポーター同様にエクソン5B優位に変化していることが見出された。これらのことから、ASD-1とそのファミリーのRNA結合タンパク質が協調してレポーターおよび内在性遺伝子の相互排他的エクソンの選択性を制御していることが確認された。以上の結果から、レポーターによる選択的スプライシングの選択性のモニター線虫により、選択性の制御機構を解析できることが示された。

创建了微型生物来监测线虫中相互排斥的外显子的表达。该迷你基因在整个体内表达了通用表达启动子，并且每个组织都表达或两者兼而有之。当使用各种组织特异性启动子表达相同的微型基因时，发现与通用启动子一样，确认了组织特异性外显子选择性的差异，肌肉系统的外显子5a对于神经/上皮系统的外显子5B，表明组织特异性。为了确定证明组织特异性所需的顺式元素，我们引入了外显子区域和点突变的缺失，表明外显子5B上的序列不需要选择外显子5B，而内含子4上包含GCAUG的序列是选择外显子5A所需的，这表明该报告者可以搜索CIS元素。为了探索调节组织特异性的反式因子，我们在记者的线虫中诱导了EMS突变，这些线虫主要表达体内壁肌肉特异性肌肉特异性myo-3启动子的控制，并试图使用蠕虫sor的体壁肌肉中的外显肌选择性改变外显肌，并试图使用蠕虫sor的体现，并以GFP表现为GFP表达。结果表明，筛选约50,000个基因组后约有30个独立的突变体。这些突变体的表型分类，染色体图和互补研究表明，至少存在四个基因座。使用SNIP-SNPS方法映射所得的突变体，并在到目前为止的三个基因基因座上鉴定基因。其中一个编码了一种新型的RNA结合蛋白，并被命名为替代性 - 替代缺陷-1（ASD-1）。 ASD-1与线虫的另一个已知的RNA结合蛋白之一具有高序列同源性，这些双突变体是生成的，发现人体壁肌肉中的记者表达完全主导。也证实了这些RNA结合蛋白在体外内含子4上特异性结合的顺式元件。此外，在双突变体中，还发现内源基因的外显子选择性已更改为外显子5b优势，类似于记者。这些结果证实，ASD-1及其RNA结合蛋白的家族协同调节了相互排斥外显子的报告基因和内源基因的选择性。以上结果表明，可以通过记者的替代剪接的受监测线虫来分析选择性控制的机制。