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Tissue-specific pre-mRNA processing in living animals

活体动物中组织特异性前体 mRNA 加工

基本信息

批准号：
20H03181
负责人：
黒柳秀人
金额：
$ 11.4万
依托单位：
University of the Ryukyus
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、線虫の生体で組織特異的にRNAを代謝標識して濃縮する手法を開発し、主要組織におけるmRNAのRNA-seq解析を行って、線虫における組織特異的選択的プロセシングの概要を明らかにし、転写と共役したmRNAプロセシングの進行過程と組織特異的選択的プロセシングパターンとの関連性を明らかにして、この生物種における選択的mRNAプロセシングの制御機構を体系的に理解することを目指している。そのために、線虫の個体レベルでの新生mRNAを4-チオウリジンまたは4-チオウラシルで代謝標識する手法の確立を行った。そして、mRNAの品質管理機構であるnonsense-mediated mRNA decay (NMD)が不全であるsmg-2変異体を用いて新生RNAを標識・精製し、長リード次世代シーケンサーであるNanopore MinIONを用いて全長RNA配列を直接シーケンシング解析し、野生型のmRNAとの比較を行った結果、正常ならNMDで分解されてしまうmRNAスプライスバリアントを発現する遺伝子259個を同定し、EMBO Journal誌に発表した（2021年6月）。一方、ウラシルのサルベージ経路の酵素の変異体を入手あるいはゲノム編集で作製してスクリーニングし、シチジン/ウリジン一リン酸キナーゼをコードする遺伝子の変異体では4-TUがほとんどRNAに取り込まれないことを見出しており、この変異体の特定の組織にcDNAを発現させることで、組織特異的に発現するレスキュー株を作製している。これらの株は、各組織における遺伝子発現の解析、および新生RNAの動態解析に利用できると期待されることから、新生RNAの代謝標識と精製を試みている。

In this study, the development of tissue-specific RNA metabolic markers, concentration methods, RNA-seq analysis of major tissue-specific mRNA, and the summary of tissue-specific RNA selection in worms were investigated. The expression of mRNA in the selected species and its regulatory mechanism are understood as a function of the target gene. The method of establishing the new mRNA in the individual cells of the worm was established by 4-channel analysis. The quality control mechanism for mRNA was established by using a nonsense-mediated mRNA decay (NMD) assay to identify, refine, and purify nascent RNA. The Nanopore MinION was used to determine the sequence of full-length RNA. Direct analysis of wild-type mRNA and comparison of wild-type mRNA was performed. Normal NMD digestion was performed. 259 fragments were identified. EMBO Journal (June 2021). The enzyme variant of a protein pathway is initiated by a sequence of genes that are encoded in a sequence of 4-TU RNA sequences and expressed in a tissue-specific cDNA sequence. The analysis of gene expression in different tissues, the analysis of DNA and the dynamic analysis of nascent RNA, the analysis of DNA expression in different tissues, the analysis of DNA