ソフトな相互作用からなる複合体のMSとNMRによる統合的な構造解析法の開発

ソフトな相互作用により形成されるタンパク質複合体の構造機能解析を行うことを目的として以下のような研究を行った。転写因子c-Myb DNA結合ドメイン(c-Myb DBD)と転写因子HSF3 DNA結合ドメイン(HSF3 DBD)の相互作用について解析した。両タンパク質は、強くはないものの特異的に相互作用することを、ESI-MSで確認し、結合のストイキオメトリーを1:1と決定した。続いてアミノ基に対する架橋反応とMSで詳細に解析することにより、架橋された部位を特定し、複合体を形成するタンパク質の相対的位置関係を解析した。リンカーの長さが(CH_2)_2ずつ異なる5種類の架橋試薬を用いることで、架橋を有するペプチドの帰属が行いやすくなること、また、架橋試薬のリンカーの長さから架橋されたアミノ基間の距離情報が得られることがわかった。さらに、15N標識したHSF3 DBDを用いた場合と用いない場合の結果と比較することで、HSF3 DBD由来のペプチドを含むペプチドを明確に見分けられ、これによってもペプチドピークの帰属の確実性を向上できることがわかった。これらの実験からHSF3 DBDとc-Myb DBDの相対的な位置に関して解析するとともに、15N標識したHSF3 DBDを用いて、長土居有隆博士の協力で、c-Myb DBDの存在の有無の2状態で15N一標識HSF3 DBDの1H/15NHSQCスペクトルを測定し、総合的にデータを解析した。その結果、HSF3 DBD第2ヘリックスとc-MybDBD Repeat 2の第2ヘリックス、HSF3のC末端部分とc-Myb DBD Repeat 3の第2ヘリックスが近接していることが示唆され、この手法が、特異性はあるが親和性の低いタンパク質複合体の構造について解析する場合、有効であることがわかった。

ソフトな相互作用により形成されるタンパク質複合体の構造機能解析を行うことを目的として以下のような研究を行った。転写因子c-Myb DNA結合ドメイン(c-Myb DBD)と転写因子HSF3 DNA結合ドメイン(HSF3 DBD)の相互作用について解析した。両タンパク質は、強くはないものの特異的に相互作用することを、ESI-MSで確認し、結合のストイキオメトリーを1:1と決定した。続いてアミノ基に対する架橋反応とMSで詳細に解析することにより、架橋された部位を特定し、複合体を形成するタンパク質の相対的位置関係を解析した。リンカーの長さが(CH_2)_2ずつ異なる5種類の架橋試薬を用いることで、架橋を有するペプチドの帰属が行いやすくなること、また、架橋試薬のリンカーの長さから架橋されたアミノ基間の距離情報が得られることがわかった。さらに、15N標識したHSF3 DBDを用いた場合と用いない場合の結果と比較することで、HSF3 DBD由来のペプチドを含むペプチドを明確に見分けられ、これによってもペプチドピークの帰属の確実性を向上できることがわかった。これらの実験からHSF3 DBDとc-Myb DBDの相対的な位置に関して解析するとともに、15N標識したHSF3 DBDを用いて、長土居有隆博士の協力で、c-Myb DBDの存在の有無の2状態で15N一標識HSF3 DBDの1H/15NHSQCスペクトルを測定し、総合的にデータを解析した。その結果、HSF3 DBD第2ヘリックスとc-MybDBD Repeat 2の第2ヘリックス、HSF3のC末端部分とc-Myb DBD Repeat 3の第2ヘリックスが近接していることが示唆され、この手法が、特異性はあるが親和性の低いタンパク質複合体の構造について解析する場合、有効であることがわかった。