低分子量GTPaseの活性化動態の定量解析技術の開発と医学への応用

低分子GTP酶活化动力学定量分析技术开发及医药应用

• 批准号: 18038031
• 负责人: 上田 修司
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18038031/
• 关键词: Ras; Rho; 定量的解析

低分子量GTPaseであるRasファミリーとRhoファミリーは、細胞内シグナル伝達のON/OFFを制御する分子スイッチとして機能しており、これらの活性調節異常は癌の発症に深く関与している。我々は、活性型低分子量GTPaseとエフェクター分子の特異的な結合特性に基づき、様々なエフェクター分子由来のポリペプチドプローブを作製し、低分子量GTPaseの活性化を免疫染色の要領で検出する方法を開発した。18年度は、Rasに対する新規プローブの開発を目指して、候補に挙がったエフェクター分子からプローブを作製し、低分子量GTPaseに対する特異性の検討を行った。また、プローブの検出感度の向上を目指して、エフェクター分子の結合ドメインを複数個繋ぐ事により結合力の強化を図った。活性の定量化法としては、データの客観性を高める手段として、プローブの検出を酵素免疫染色法(ELISA)で行う比色定量法を開発した。また、共焦点顕微鏡で撮影した蛍光免疫染色画像の蛍光強度をデジタル解析する事で、細胞内の低分子量GTPaseの活性の強さを3次元的に視覚化する事が可能になった。今回作製したプローブを用いて、癌培養細胞を検討したところ、Rasの恒常的活性型変異を有する癌細胞(SW480、PANC-1)では内在性Rasの活性が強く検出された。この結果は、従来法である細胞可溶化液を用いて行うプルダウンアッセイの結果と一致していた。細胞機能の多くは、複数の低分子量GTPaseの複雑なクロストークによって制御を受けている事から、さらに低分子量GTPase毎に異なる蛍光波長で検出する事ができるプローブを作製した。低分子量GTPaseの活性型変異体を発現する細胞で検討したところ、これらのプローブを用いれば二つの低分子量GTPaseの活性を同一細胞上で同時に検出し、比較する事ができる事がわかった。

Low molecular weight GTase has been implicated in the regulation of Ras and Rho activity in the development of cancer. We have developed a method for the identification of specific binding properties of active low molecular weight GTPases, and for the identification of immunostaining methods for the activation of low molecular weight GTPases. In 2018, the development of new regulations for Ras, the control of candidate molecules for Ras, and the investigation of specificity for low molecular weight GTases were carried out. The sensitivity of the molecule is increased, and the binding force of the molecule is strengthened. Quantitative method of activity, enzyme immunostaining (ELISA) and colorimetric quantitative method were developed. The intensity analysis of photoimmunostaining images by confocal microscopy and the intensity of intracellular low-molecular-weight GTase activity by three-dimensional visualization are possible. In the present study, the activity of intrinsic Ras was strongly detected in cultured cancer cells (SW480, PANC-1). The results were consistent with those obtained by using cell solubilizer. Cell function of multiple, multiple low molecular weight GTPases complex control process, control process, low molecular weight GTPases each different wavelength of light detection process. The activity of two low molecular weight GTases is detected simultaneously in the same cell and compared with each other.