シグナル伝達系の再構成

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本研究は、シグナル伝達系を試験管内で再構成し、その速度論的な性質を明らかにすることを目的として行った。具体的には、蛍光相関分光法でシグナル伝達系における相互作用反応を測定し、さらに複数の相互作用段階からなる一連の系路を試験管内で再構成し、その系路の各部分や全体での速度論的パラメーターを測定することを計画した。解析対象には、最も詳細に解析がなされているシグナル伝達系であるTNFシグナル伝達系を用い、その構成要素の相互作用によって下流へのシグナル伝達が行われる過程を試験管内で再構成するために、これらの構成要素の組換えタンパク質発現、および蛍光標識を行い、蛍光相関分光法による相互作用解析を行った。しかし、タンパク質間の親和性が非常に高い場合は、蛍光相関分光法による解析では再現性のある結果を得ることが困難であった。そこで、他の手法を用いた相互作用解析を検討し、QCM(水晶結晶発振子)による解析を行うこととした。そこで、まず測定系を確立するために、既知の低親和性、高親和性リガンドを部位特異的変異体として調整し、大腸菌発現系において組換えタンパク質を発現、調整した。同様に可溶型受容体を調整し、リガンド-受容体間の相互作用定数の測定を行った。また、電極面へのタンパク質の固定化方法の検討、および解析目的とする他の組換えタンパク質の発現系の構築を行った。