シグナル伝達系の再構成

信号转导系统重组

• 批准号: 18048006
• 负责人: 宮寺 浩子
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18048006/
• 关键词: シグナル伝達; 分子間相互作用

本研究は、シグナル伝達系を試験管内で再構成し、その速度論的な性質を明らかにすることを目的として行った。具体的には、蛍光相関分光法でシグナル伝達系における相互作用反応を測定し、さらに複数の相互作用段階からなる一連の系路を試験管内で再構成し、その系路の各部分や全体での速度論的パラメーターを測定することを計画した。解析対象には、最も詳細に解析がなされているシグナル伝達系であるTNFシグナル伝達系を用い、その構成要素の相互作用によって下流へのシグナル伝達が行われる過程を試験管内で再構成するために、これらの構成要素の組換えタンパク質発現、および蛍光標識を行い、蛍光相関分光法による相互作用解析を行った。しかし、タンパク質間の親和性が非常に高い場合は、蛍光相関分光法による解析では再現性のある結果を得ることが困難であった。そこで、他の手法を用いた相互作用解析を検討し、QCM(水晶結晶発振子)による解析を行うこととした。そこで、まず測定系を確立するために、既知の低親和性、高親和性リガンドを部位特異的変異体として調整し、大腸菌発現系において組換えタンパク質を発現、調整した。同様に可溶型受容体を調整し、リガンド-受容体間の相互作用定数の測定を行った。また、電極面へのタンパク質の固定化方法の検討、および解析目的とする他の組換えタンパク質の発現系の構築を行った。

进行这项研究的目的是重建体外信号转导系统并阐明其动力学特性。具体而言，它计划使用荧光相关光谱法测量信号转导系统中的相互作用反应，然后重建一系列由试管中的多个相互作用阶段组成的一系列区域，并测量每个部分和整个片段的动力学参数。分析目标是TNF信号系统，以最详细的方式分析的信号系统，并且为了重建通过组件的相互作用通过相互作用的信号传导下游的过程，这些组件被表达了重组蛋白和荧光标记，并通过荧光互联型荧光面进行了相互作用分析。但是，当蛋白质之间的亲和力很高时，很难通过使用荧光相关光谱法分析获得可再现的结果。因此，我们使用其他方法研究了交互分析，并决定使用QCM（石英晶体振荡器）进行分析。因此，为了建立一个测量系统，首先将已知的低亲和力，高亲和力配体调整为定位突变体，并在大肠杆菌表达系统中表达并调整了重组蛋白。同样，制备可溶性受体，并测量配体 - 受体相互作用常数。此外，研究了将蛋白固定在电极表面上的方法，并构建了其他重组蛋白的表达系统。