蛍光一分子解析によるTNFシグナル伝達系の速度論的解析

使用单分子荧光分析对 TNF 信号转导系统进行动力学分析

• 批准号: 16770092
• 负责人: 宮寺 浩子
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16770092/
• 关键词: 蛍光相関分光法; シグナル伝達

蛍光相関分光法によって相互作用解析を行うためには、タンパク質の機能・構造に影響を及ぼさない部位に低分子蛍光分子を標識する必要がある。このため、申請者はN末端への部位特異的蛍光修飾を行うために、N末端にセリンを有する組換えタンパク質の発現を行うための発現ベクターを構築した。また、N末端セリンの酸化と、ヒドラジン化した蛍光分子の重合による、タンパク質のN末端を部位特異的に標識する方法により蛍光標識を行った。さらに、この方法で蛍光標識した組換えタンパク質を未標識タンパク質や未反応蛍光分子から分離・精製するための条件を検討し、HPLCによって分離・精製する方法を確立した。解析に用いるリガンドをこの方法で発現・標識・精製し、その溶液中での動態を蛍光相関分光法で測定した結果、蛍光標識リガンドが、生体内と同様、高濃度でホモ3量体を形成することが確認された。また、大腸菌・酵母などのさまざまな組換えタンパク質発現系を検討し、ショウジョウバエ細胞株S2発現系が、タンパク質の種類・性質に関わらず、本研究で用いる組換えタンパク質の発現に最も最適であることを確認した。また、受容体などの膜タンパク質は、膜画分からの可溶化が必要であり、化学的な蛍光修飾反応後の精製が困難であることが予想されたため、蛍光タンパク質との融合により、蛍光修飾することとした。蛍光相関分光法に使用する蛍光分子は、高い蛍光強度と安定性を持つ必要がある。そこで、一般的に用いられている数種の蛍光タンパク質について、蛍光相関分光法で蛍光を検出することが可能であるかを、これらの蛍光タンパク質を組換えタンパク質として調製し、確認した。その結果、緑色蛍光タンパク質としてEGFP、赤色単量体型蛍光タンパク質としてmKO1が使用可能であることが明らかになった。

The interaction analysis of optical phase spectroscopy is used to analyze the interaction between low molecular weight photolecules and low molecular weight photolecules in the imaging and imaging sites. The light repair system in the special part of the N-terminal part of the applicant and the applicant, and the light repair system in the N-terminal part of the applicant, the applicant, the applicant and the applicant in the N-terminal part, the light repair line, the light repair line Target, N-terminal, acidification, photomolecular coincident, N-terminal, and so on. You need to know that you are not aware of the information you need to know that the optical molecules are separated from each other, and that the conditions are correct, and that the HPLC method is correct. The analytical method was used to determine the results of the measurement results, the results of the determination of the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the photometric method, the results of the measurement results, the results of the measurement results, the Strains of bacteria, yeast, yeast, yeast and yeast. The film, the capacitor, the film, the The "optical phase" spectroscopic method uses light molecules and high light intensity to maintain the necessary stability. In general, several kinds of optical equipment are used to obtain the information that may be detected by photospectrum spectrometry. it is necessary to verify the information and confirm the information. The results are as follows: color measurement, color measurement, EGFP measurement, red measurement, light measurement, light measurement, and mKO1 use.