人工神経内分泌小胞によるシステム細胞工学

使用人工神经内分泌囊泡的系统细胞工程

• 批准号: 18048030
• 负责人: 鍔木 基成
• 金额: $ 6.98万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18048030/
• 关键词: シトクロムb561; シトクロムb5; 膜タンパク質; アスコルビン酸; ビタミンC; 電子伝達反応; リポソーム; 人工小胞

動物の神経内分泌小胞にはcytochrome b561を中心とする膜貫通電子伝達系が存在し,細胞質のアスコルビン酸(AsA)から小胞内の銅含有酸素添加酵素への電子伝達を媒介している。この反応は小胞内での神経伝達物質合成反応に必須である。本研究では、脳神経内分泌組織に特異的な電子伝達・酵素反応系の構造と機能,そして小胞の輸送・融合現象・開口放出の解明するため,多機能プロテオリポソームを使ったアプローチを行う。人工小胞膜および内側に膜酵素・膜タンパク質を埋め込んだプロテオリポソームを作製し,小胞外からは基質・神経ペプチドをTAドメインを利用した輸送系で,電子当量はb561により供給して,小胞内で神経伝達物質の合成を行わせ,特異的な電子伝達系・酵素反応系の構造と機能を解明する。本年度は、次のような段階的な実験・解析を行った。(1)安定プロテオリポソームの作製技術の完成:AsA,野生型b5からなるプロテオリポソームを構築するための条件検索。(2)TAドメインを用いたプロテオリポソーム内腔への物質輸送系の構築:ヒトb5のTAドメインのリボソーム膜への結合とリボソーム内腔への自立的移動による輸送系を構築することを目指して、TAドメインに種々の変異・延長を導入したb5変異体を大腸菌で発現させる系を構築し,その発現・精製に成功した。(3)b561によるAsA依存性膜貫通電子伝達反応機構を解明するために,植物トウモロコシ由来b561を酵母Pichia pastorisにおいて大量発現させる系を構築し,野生型とAsA結合部位,MDA結合部位周辺での特異的変異体を精製して種々の酵素的・タンパク質化学的測定を行った。その結果,植物b561でも動物b561と同様な機構に基づくAsA由来電子伝達反応が機能していることが明らかとなった。

In animals, membrane-penetrating electron transfer systems exist in the center of neuroendocrine vesicles, and cytosolic acid (AsA) and intracellular copper contain acid-adding enzymes and electron transfer mediators. The reaction must be carried out within the cell to reach the synthesis of matter. In this study, we investigated the structure and function of electron transfer and enzyme reaction system specific to endocrine tissues, including the transport and fusion phenomena of small cells, and the release of light from openings. To study the structure and function of enzyme reaction system, electron equivalent b561 supply system, enzyme reaction system, electron equivalent b561 supply system. This year's analysis of the second phase of the project (1)Completion of the working technique for stable solution:AsA, wild-type b5 (2)TA The construction of material transport system in the inner cavity of the solution: the construction of transport system in the inner cavity of the solution: the construction of transport system in the inner cavity of the solution (3) AsA-dependent membrane-penetrating electron transfer reaction mechanism was elucidated in plants. The origin of b561 in yeast Pichia pastoris was studied. The system was constructed. The wild-type AsA-binding site and MDA binding site were isolated. The enzyme was purified. As a result, plant b561 and animal b561 have the same structure as AsA.

项目成果

Protein-protein interaction of cytochrome b_<561> in chromaffin vesicle membranes studied by two-dimensional blue-native/sodium dodecyl sulfate gele electrophoresis and co-immunoprecipitation analysis

通过二维蓝色天然/十二烷基硫酸钠凝胶电泳和免疫共沉淀分析研究嗜铬囊泡膜中细胞色素 b_<561> 的蛋白质-蛋白质相互作用

• 发表时间: 2006
• 期刊: Acta Biologica Szegediensis 50・1-2
• 作者: Morimoto N;Hasegawa U;Sugawara A;Yamane S;Akiyoshi K;鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motollari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki)
• 通讯作者: 鍔木基成(Motonari Tsubaki)

Characterization of heme-coordinating histidyl residues of an engineere six-coordinated my oglobin mutant based on the reactivity with diethoxylpyrocarbonate, mass spectrometry and EPR sspectroscopy

基于与二乙氧基焦碳酸酯的反应性、质谱法和 EPR 光谱法对工程六配位 my oglobin 突变体的血红素配位组氨酰残基进行表征

• 发表时间: 2008
• 期刊: J. Biosci. Biotechnol. (in press)
• 作者: Morimoto N;Hasegawa U;Sugawara A;Yamane S;Akiyoshi K;鍔木基成(Motonari Tsubaki)
• 通讯作者: 鍔木基成(Motonari Tsubaki)

Histidine cycle mechanism for the concerted proton/electron transfer from ascorbate to the cytosolic heme b center of cytochrome b_561: Aunique machinery for the biological transme mbrane electron transfer

用于从抗坏血酸到细胞色素 b_561 的胞质血红素 b 中心的协调质子/电子转移的组氨酸循环机制：生物跨膜电子转移的独特机制

• 发表时间: 2007
• 期刊: Journal of Biochemistry 142巻・5号
• 作者: Morimoto N;Hasegawa U;Sugawara A;Yamane S;Akiyoshi K;鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki)
• 通讯作者: 鍔木基成(Motonari Tsubaki)

Purification and biochemical analyses of Zea mays cytochrome b_561 heterologously expressed in Pichia pastoris

毕赤酵母异源表达玉米细胞色素b_561的纯化及生化分析

• 发表时间: 2007
• 期刊: 2007 International Symposium on Micro-Nano Mechatronics and Human Science IEEE, なし
• 作者: Morimoto N;Hasegawa U;Sugawara A;Yamane S;Akiyoshi K;鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki)
• 通讯作者: 鍔木基成(Motonari Tsubaki)

Interaction of tail-anchored proteins with liposomes in different cholesterol content; Initial steps for the fabrication of artificial neuroendocrine vesicles

不同胆固醇含量下尾锚定蛋白与脂质体的相互作用；

• 发表时间: 2007
• 期刊: International symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science Symposium "Micro- and Nano-Mechatronics for Information-Based Society", The 21st Century COE Program (in press)
• 作者: Morimoto N;Hasegawa U;Sugawara A;Yamane S;Akiyoshi K;鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motollari Tsubaki)
• 通讯作者: 鍔木基成(Motollari Tsubaki)