人工神経内分泌小胞によるシステム細胞工学

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動物神経内分泌小胞にはシトクロムb561を中心とする膜貫通電子伝達系が存在し,細胞質アスコルビン酸(AsA)から小胞内酸素添加酵素への電子伝達を媒介している。この反応は小胞内での神経伝達物質合成に必須である。本研究では人工小胞に膜酵素・タンパク質を埋め込んだプロテオリポソームを作製し,小胞外からペプチド基質をTAドメインを利用した輸送系,電子当量はb561により供給し,小胞内で神経伝達物質の合成を行わせることにより特異的電子伝達・酵素反応系の構造と機能を解明することが目的である。H21年度は(1) TAドメインを用いたリポソーム内腔への物質輸送系の構築を目指し、ヒトcytochrome b5のTAドメインを利用した輸送系を構築するために、TAドメインに種々の変異・延長を導入したb5変異体の大腸菌での発現と精製に成功した。(2) b561によるAsA依存性膜貫通電子伝達反応機構を解明するため,植物トウモロコシ由来b561を酵母Pichia pastorisにおいて大量発現させ,野生型とAsA結合部位,MDA結合部位周辺,膜貫通部位での特異的変異体を精製してpulse radiolysis, stopped-flow及び電気化学的測定を行った。その結果,植物b561でも動物b561と同様な機構に基づくAsA由来の電子伝達反応が機能していることが明らかとなった。(3) ヒトの持つcytochrome b561のホモログのひとつで、癌抑制遺伝子候補産物101F6タンパク質の大量発現と精製に成功し、AsAに由来する電子伝達反応及び電気化学的解析を行った。