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人工神経内分泌小胞によるシステム細胞工学

使用人工神经内分泌囊泡的系统细胞工程

基本信息

批准号：
20034034
负责人：
鍔木基成
金额：
$ 4.03万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

動物神経内分泌小胞にはシトクロムb561を中心とする膜貫通電子伝達系が存在し,細胞質アスコルビン酸(AsA)から小胞内酸素添加酵素への電子伝達を媒介している。この反応は小胞内での神経伝達物質合成に必須である。本研究では人工小胞に膜酵素・タンパク質を埋め込んだプロテオリポソームを作製し,小胞外からペプチド基質をTAドメインを利用した輸送系,電子当量はb561により供給し,小胞内で神経伝達物質の合成を行わせることにより特異的電子伝達・酵素反応系の構造と機能を解明することが目的である。H21年度は(1) TAドメインを用いたリポソーム内腔への物質輸送系の構築を目指し、ヒトcytochrome b5のTAドメインを利用した輸送系を構築するために、TAドメインに種々の変異・延長を導入したb5変異体の大腸菌での発現と精製に成功した。(2) b561によるAsA依存性膜貫通電子伝達反応機構を解明するため,植物トウモロコシ由来b561を酵母Pichia pastorisにおいて大量発現させ,野生型とAsA結合部位,MDA結合部位周辺,膜貫通部位での特異的変異体を精製してpulse radiolysis, stopped-flow及び電気化学的測定を行った。その結果,植物b561でも動物b561と同様な機構に基づくAsA由来の電子伝達反応が機能していることが明らかとなった。(3) ヒトの持つcytochrome b561のホモログのひとつで、癌抑制遺伝子候補産物101F6タンパク質の大量発現と精製に成功し、AsAに由来する電子伝達反応及び電気化学的解析を行った。

In animals, membrane-penetrating electron transfer systems exist in endocrine cells, mediated by cytosolic acid (AsA) and small intracellular acid-adding enzymes. This is a necessary step in the synthesis of substances in the brain. The purpose of this study is to investigate the structure and function of enzyme reaction system in cells by using transport system and electron equivalent b561 supply. H21 year (1) TA solution for the construction of a substance transport system in the lumen of the target, the use of cytochrome b5 for the construction of a substance transport system, TA solution for the introduction of different species of Escherichia coli and purification success. (2)AsA-dependent membrane-penetrating electron transfer mechanism was elucidated in plants and derived from b561 in yeast Pichia pastoris. Wild-type AsA-binding site,MDA binding site, membrane-penetrating site specific variants were purified, pulse radiolysis, stopped-flow and electrochemical measurements were performed. As a result, plant b561 and animal b561 have the same structure. (3)A large amount of production and purification of the candidate product of cancer suppressor gene 101F6 was successfully carried out. The electron transfer reaction and electrochemical analysis of AsA origin were carried out.

项目成果

期刊论文数量（8）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Structural and mechanistic roles of three consecutive Pro residues of porcine NADH-cytochrome, b5 reductase for the binding of β-NADH

猪 NADH-细胞色素、b5 还原酶的三个连续 Pro 残基对 β-NADH 结合的结构和机械作用

DOI：
发表时间：
2009
期刊：
J. Biosci. Bioeng (in press)
影响因子：
0
作者：
鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki)
通讯作者：
鍔木基成(Motonari Tsubaki)

Characterization of heme-coordinating histidyl residues of an engineered six-coordinated myoglobin mutant based on the reactivity with diethoxylpyrocarbonate, mass spectrometry and EPR spectroscopy

基于与二乙氧基焦碳酸酯的反应性、质谱和 EPR 光谱对工程六配位肌红蛋白突变体的血红素配位组氨酰残基进行表征

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
J. Biosci. Bioeng. 105
影响因子：
0
作者：
鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki)
通讯作者：
鍔木基成(Motonari Tsubaki)

Importance of conserved Lys^<83> residue of Zea mays cytochrome b_561 for ascorbate-specific transmembrane electron transfer as revealed by site-directed mutagenesis studies

定点诱变研究揭示了玉米细胞色素 b_561 的保守 Lys^<83> 残基对于抗坏血酸特异性跨膜电子转移的重要性

DOI：
发表时间：
2009
期刊：
Biochemistry 48
影响因子：
0
作者：
鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki)
通讯作者：
鍔木基成(Motonari Tsubaki)

Roles of conserved amino acid residues on the extravesicular side of Zea mays cytochrome b561 for the ascorbate-specific transmembrane electron transfer

玉米细胞色素 b561 囊外侧保守氨基酸残基在抗坏血酸特异性跨膜电子转移中的作用

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成(Motonari Tsubaki);鍔木基成;鍔木基成(Motonari Tsubaki)
通讯作者：
鍔木基成(Motonari Tsubaki)

Structural and mechanistic roles of three consecutive Pro residues of porcine NADH-cytochrome b_5 reductase for the binding of β-NADH

猪 NADH-细胞色素 b_5 还原酶的三个连续 Pro 残基对 β-NADH 结合的结构和机械作用