DNA複製における不連続合成装置複合体形成と再編

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昨年度にP.furiosus由来のDNAリガーゼ(PfuLig)の結晶構造を決定して、本酵素のDNA結合反応に必要な構造的要素を提唱した。PfuLigはin vitroにおいてはP.furiosus細胞中のような高塩濃度環境下では活性を示さないが、PCNAとの結合により反応が促進されることを実証し、その際の相互作用様式を明らかにした。この相互作用様式は、それまで知られていたPCNAとPCNA結合蛋白質との相互作用に見られるものと異なる新規なものであり、PCNA結合領域が蛋白質の末端にあるのではなく、内側のループアウトした領域に位置するものであった。そこで、この結合様式がアーキアのリガーゼに共通に見られるものであることを確かめるために配列比較を行い、アーキアのもう一つのサブドメイン(クレナーキオタ)に属するA.pernixのDNAリガーゼ(ApeLig)を用いて、予想した結合領域が実際に働いていることを実験的に確かめた。これらの実験結果から、ヒトDNAリガーゼ-PCNA間にもこのような相互作用様式が存在することが予想される。さらに我々は、不連続鎖のニックシールを司る複合体(Lig-PCNA-ニックDNA)を単離し、結晶化を試みるとともに、電子顕微鏡観察による単粒子解析によって、この複合体の3次元モデルを構築することに成功した(論文執筆中)。また、平行して、PCNA-DNAポリメラーゼーDNAの三者複合体の構造解析も進めているが、その中でPCNA-DNAポリメラーゼ複合体の結晶化に成功した。現在この構造解析がほぼ終了している(論文執筆中)。さらにDNAポリメラーゼとPCNAとの相互作用部位の同定と、その定量化を行い発表した。クレナーキオタにはPCNA分子を複数持つものがあり、A.pernixには3種のPCNA(PCNA1,PCNA2,PCNA3)が存在する。我々は、これらのPCNAがどのように役割分担をしているのかを理解するために、A.pernixの構造・機能解析を進めた。その結果、このPCNAはPCNA2だけのホモ3量体のほかにPCNA2と3または1,2,3からなるヘテロ3量体の3種の複合体構造を形成しうることを証明し、それによって細胞内での機能を分担して担っていることを提唱した。2種類のDNAポリメラーゼ、PolI,PolIIのうちPolIIは3種のどのPCNAとも同様の親和性を持って結合するが、PolIはPCNA2に特異性を示した。またRFC,DNAリガーゼ、FEN1エンドヌクレアーゼは、それぞれ、PCNA2,PCNA3,PCNA2との特異的な相互作用を有することがわかった。これらの蛋白質を用いて、レプリソームの形成と再編の分子機構の理解を深めたいと考えている。