DNA複製における不連続合成装置複合体形成と再編

DNA复制中不连续合成复合物的形成和重组

• 批准号: 18054024
• 负责人: 石野 良純
• 金额: $ 4.03万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18054024/
• 关键词: DNA 複製装置; アーキア; 超好熱菌; DNA ポリメラーゼ; DNA リガーゼ; 結晶構造解析; 電子顕微鏡觀察; 複合体再編; DNA複製; 組換え修復; レプリソーム複合体

昨年度にP.furiosus由来のDNAリガーゼ(PfuLig)の結晶構造を決定して、本酵素のDNA結合反応に必要な構造的要素を提唱した。PfuLigはin vitroにおいてはP.furiosus細胞中のような高塩濃度環境下では活性を示さないが、PCNAとの結合により反応が促進されることを実証し、その際の相互作用様式を明らかにした。この相互作用様式は、それまで知られていたPCNAとPCNA結合蛋白質との相互作用に見られるものと異なる新規なものであり、PCNA結合領域が蛋白質の末端にあるのではなく、内側のループアウトした領域に位置するものであった。そこで、この結合様式がアーキアのリガーゼに共通に見られるものであることを確かめるために配列比較を行い、アーキアのもう一つのサブドメイン(クレナーキオタ)に属するA.pernixのDNAリガーゼ(ApeLig)を用いて、予想した結合領域が実際に働いていることを実験的に確かめた。これらの実験結果から、ヒトDNAリガーゼ-PCNA間にもこのような相互作用様式が存在することが予想される。さらに我々は、不連続鎖のニックシールを司る複合体(Lig-PCNA-ニックDNA)を単離し、結晶化を試みるとともに、電子顕微鏡観察による単粒子解析によって、この複合体の3次元モデルを構築することに成功した(論文執筆中)。また、平行して、PCNA-DNAポリメラーゼーDNAの三者複合体の構造解析も進めているが、その中でPCNA-DNAポリメラーゼ複合体の結晶化に成功した。現在この構造解析がほぼ終了している(論文執筆中)。さらにDNAポリメラーゼとPCNAとの相互作用部位の同定と、その定量化を行い発表した。クレナーキオタにはPCNA分子を複数持つものがあり、A.pernixには3種のPCNA(PCNA1,PCNA2,PCNA3)が存在する。我々は、これらのPCNAがどのように役割分担をしているのかを理解するために、A.pernixの構造・機能解析を進めた。その結果、このPCNAはPCNA2だけのホモ3量体のほかにPCNA2と3または1,2,3からなるヘテロ3量体の3種の複合体構造を形成しうることを証明し、それによって細胞内での機能を分担して担っていることを提唱した。2種類のDNAポリメラーゼ、PolI,PolIIのうちPolIIは3種のどのPCNAとも同様の親和性を持って結合するが、PolIはPCNA2に特異性を示した。またRFC,DNAリガーゼ、FEN1エンドヌクレアーゼは、それぞれ、PCNA2,PCNA3,PCNA2との特異的な相互作用を有することがわかった。これらの蛋白質を用いて、レプリソームの形成と再編の分子機構の理解を深めたいと考えている。

Yesterday's annual に P.f uriosus origin の DNA リ ガ ー ゼ (PfuLig) の crystal structure を decided し て, this enzyme の DNA combined anti 応 に を な structure elements necessary to mention sing し た. PfuLig は in vitro に お い て は P.f uriosus cells の よ う な under the environment of high salt concentration で を は activity in さ な い が, PCNA と の combining に よ り anti 応 が promote さ れ る こ と を be し, そ の interstate の interaction others type を Ming ら か に し た. こ の interaction others type は, そ れ ま で know ら れ て い た PCNA と PCNA binding protein と の interaction に see ら れ る も の と different な る new rules な も の で あ り, PCNA protein binding domain が の end に あ る の で は な く, medial の ル ー プ ア ウ ト し に た field position す る も の で あ っ た. そ こ で, こ の combined with others in type が ア ー キ ア の リ ガ ー ゼ に に see common ら れ る も の で あ る こ と を か indeed め る た め に line column is を い, ア ー キ ア の も う a つ の サ ブ ド メ イ ン (ク レ ナ ー キ オ タ) に genus す る Amy polumbo ernix の DNA リ ガ ー ゼ (ApeLig) を い て, to want to し が た combining field be international Youdaoplaceholder0 に て る る とを とを the に of the experiment めた めた. こ れ ら の be 験 results か ら, ヒ ト DNA リ ガ ー ゼ - between PCNA に も こ の よ う な interaction others, there exist す が る こ と が to think さ れ る. さ ら に I 々 は, not even 続 lock の ニ ッ ク シ ー ル を department る complex (Lig - PCNA - ニ ッ ク DNA) を 単 し, crystallization を try み る と と も に, electronic 顕 micromirror 観 examine に よ る 単 particle analytical に よ っ て, こ の complex 3 dimensional の モ デ ル を build す る こ と に successful し た (paper) in written. ま た, parallel し て, PCNA - DNA ポ リ メ ラ ー ゼ ー DNA complex の の three tectonic analytical も into め て い る が, そ の で of PCNA - DNA ポ リ メ ラ ー ゼ complex の crystallization に successful し た. Now, the analysis of the structure of がほぼ is completed. The paper is て and る(in the process of writing). Youdaoplaceholder0 DNAポリメラ ポリメラ ゼと ゼとPCNAと <s:1> the interaction sites of <s:1> are fixed と and そ are quantified を and <s:1> occur た た. ク レ ナ ー キ オ タ に は PCNA molecular を plural hold つ も の が あ り, Amy polumbo ernix に は three の PCNA (PCNA1, PCNA2, PCNA3) が す る. I 々 は, こ れ ら の PCNA が ど の よ う cut に service sharing を し て い る の か を understand す る た め に, Amy polumbo ernix の structure, functional analytic を into め た. そ の results, こ の PCNA は PCNA2 だ け の ホ モ 3 quantity body の ほ か に PCNA2 と 3 ま た は 1, 2, 3 か ら な る ヘ テ ロ 3 quantity body の three の complex tectonic を form し う る こ と を し, そ れ に よ っ て in cells で の function を share し て bear っ て い る こ と を mention sing し た. 2 kinds の ポ DNA リ メ ラ ー ゼ, PolI, PolII の う ち PolII は three の ど の PCNA と も with others の affinity を hold っ て combining す る が, PolI は PCNA2 に specificity を shown し た. ま た RFC, DNA リ ガ ー ゼ, FEN1 エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ は, そ れ ぞ れ, PCNA2 PCNA3, PCNA2 と の specific な interaction を have す る こ と が わ か っ た. こ れ ら の protein を い て, レ プ リ ソ ー ム の form と again make の molecules institutions の understand を deep め た い と exam え て い る.

项目成果

DNA ライゲーション反応におけるDNAリガーゼの動的構造変化〜アーキア由来DNAリガーゼを用いた研究

DNA 连接反应过程中 DNA 连接酶的动态结构变化 ~ 使用古细菌来源的 DNA 连接酶进行研究

• 发表时间: 2007
• 作者: Nozaki S;Niki;H;Ogawa;T;清成信一
• 通讯作者: 清成信一

PCNAを中心としたDNA複製装置複合体の形成と再編に関する研究

以PCNA为中心的DNA复制装置复合体的形成与重组研究

• 发表时间: 2007
• 作者: Sasaki;K.;Ose;T.;Okamoto;N.;Maenaka;K.;Tanaka;T.;Masai;H.;Saito;M.;Shirai;T.and Kohda;D.;石野良純
• 通讯作者: 石野良純

Crystallization and preliminary crystallographic shudy of DNA polymerase from Pyrococcus furiosus

强烈火球菌DNA聚合酶的结晶及初步晶体学研究

• 发表时间: 2007
• 期刊: Protein Pept Lett. 14
• 作者: Nishida;H.;et. al.
• 通讯作者: et. al.

P. furiosus におけうDNA複製フォーク進行の分子機構解析〜GINS複合体について〜

P. Furiosus DNA复制叉进程的分子机制分析~关于GINS复合体~

• 发表时间: 2007
• 作者: 石野良純;他
• 通讯作者: 他

超好熱性アーキア Pyorcoccus furiosus Cdc6/0rc1 の生化学的解析

超嗜热古菌激烈热球菌 Cdc6/0rc1 的生化分析

• 发表时间: 2007
• 作者: 秋田真季;他
• 通讯作者: 他