DNA複製装置レプリソーム超複合体の再編による機能変換

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DNA複製はフォーク構造DNAと蛋白質複合体から構成されるレプリソームと呼ばれる超分子複合体が正しく機能することによって進行する。我々はこのレプリソーム構成蛋白質因子間の相互作用様式を理解することを目的として、複合体としての構造解析を進めた。蛋白質の構造解析技術が急速に進歩したとは言え、複製の進行に伴って時々刻々と変化するレプリソームの構成蛋白質を構造解析のために安定な複合体として単離するのはそう容易なことではない。我々の研究の特徴は、原核生物でありながらその複製、修復関連蛋白質が真正細菌のものよりも真核生物のものにより類似している古細菌由来の蛋白質を用いていることにある。古細菌の中でも超好熱古細菌由来の蛋白質は特に安定性に優れ、複合体としての構造解析にとって最も適した実験材料であると考えられる。我々は、超好熱古細菌Pyrococcus furiosus由来の蛋白質因子を用いて種々のDNA複製、修復複合体解析を進めた。連続的なDNA鎖合成のために必要なクランプ分子をDNA鎖上に乗せるクランプローディングという現象を理解するためにPCNA(クランプ)-RFC(クランプローダー)-DNA複合体の三次元構造を電子顕微鏡の単粒子解析によって解析した。その結果は大変興味深いことに環状のPCNAがRFCとの結合によって開いた状態の中間状態を観察することができ、クランプ環の開き方に関して大変重要な知見を得た。また、同様の手法を用いてPCNA-DNAポリメラーゼ複合体、PCNA-DNAリガーゼ-DNA複合体などの構造解析を進めており、複合体の単離と電顕観察像の取得に成功した。複製フォークが正しく進行しないときに働くと考えられる修復機構のためにレプリソームが再編されることが予想されるが、我々は複製フォークに特異的に働くP.furiosus由来のHjmヘリカーゼがPCNAと結合して複合体を形成することを見出し、それがヘリカーゼ単独の場合よりも活性が高いことが分かった。そこで、この複合体の構造解析を目指して安定な複合体を単離する条件検討を行った。