薬物排出の最終段階を担う新規有機カチオン輸送体の構造と機能及び相互作用

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申請者は現在までにMATEのプロトタイプのVibrio Parahaemolyticus由来のNorMに関して機能性アミノ酸残基を同定している(J Bacteriol,2005)。NorMの薬物輸送に関与する機能性アミノ酸残基は、膜貫通領域に存在している酸性アミノ酸残基であった。バクテリア由来のMATEトランスポーターのNorMは、ヒトMATE1とタンパク質レベルで23.6%の相同性しかないが、これらの酸性アミノ酸残基のうちの2つはヒト及びマウスのMATE1及びMATE2で保存されていた。以上のことから、哺乳類のMATEにおいてもこれらの酸性アミノ酸残基を含む極性アミノ酸残基が、MATEの基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構に直接関係していることが予想される。これらの予想を基にMATE1の点変異体を複数作製した。(MATEの極性残基部分:E278A,E319A,H386A,E389A 等)。そして、TEA(テトラエチルアンモニウム)の取り込み活性に与える影響をRIトレーサー実験により調べた。この結果より機能性アミノ酸残基を決定した。また、MATE1変異体の基質特異性や、輸送活性に及ぼすpHの影響に対する変化についても詳細に解析を行うことによって、OC/H+交換輸送における基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構を解明した。ヒトMATE1の膜貫通領域にある極性アミノ酸のうち、E273Qの点変異体を作成しHEK293細胞に発現させたところ、TEAの輸送活性は完全に消失した(PNAS 2005,)。また、MATE1の機能と構造を理解する上でその分子単体に注目し、大量発現・精製及びそのリポソームへの再構成系を確立した。大量発現系は、昆虫細胞を用いた発現系を用いた。また、大量発現したタンパク質を精製・リポソームに再構成し、活性の測定を行う系を構築した。こうした技術をMATEタンパク質の機能解析に応用した。そして輸送測定で基質とH^+の化学平衡か測定した。