ハロバクテリアのセンサーロドプシンIIの3次元構造

盐细菌传感器视紫红质II的三维结构

• 批准号: 13780483
• 负责人: 大塚 正人
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780483/
• 关键词: センサーロドプシン; 膜タンパク質; 大量発現

以下の項目の研究を行い、以下の結果を得た。これまでに確立したSR IIの大量発現系をもとに、Htr IIのハロバクテリアにおける機能的な大量発現系の確立を行なった。ハロバクテリアの野生株ゲノム遺伝子より、Htr IIをコードする遺伝子htr IIをflanking領域を含めてクローニングし、発現ベクターに導入した。このプラスミドを用いて、4種のロドプシンを完全に欠損した変異体を宿主としHtr IIの大量発現系を構築した。具体的にはプロモーターとしてBRのプロモーターである、bopプロモーターを用い、その下流にhtr IIをつなぐことで過剰発現できた。Htr IIの大量発現系では、2種の発現ベクターを作成した。即ち、Htr IIをBRのleader sequenceと融合させたものとleader sequenceと融合させていないものである。これらの形質転換体を単離後、発現量の差異について検討した。組み換え蛋白質の精製を簡略化するために、同蛋白質のカルボキシル基末端には6つのヒスチジンオリゴマーを融合させた。大量発現されたHtr IIは可溶化後、Ni-NTA Agaroseを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。また、SR IIとHtr IIを同時に過剰発現させる系をハロバクテリア中で構築した。大量発現した蛋白質はHtr IIの場合と同様に精製・単離した。現在、得られたタンパク質を用いてSR II及びHtr IIの3次元結晶を作成中である。

The following research projects were carried out and the following results were obtained. This is to establish the mass discovery system of SR II and the mass discovery system of Htr II. The wild plants in the wild have been introduced into the flanking field containing the genes Htr II and Htr II. With the use of this platform, four types of platforms can be hosted completely without loss and a large number of discovery systems in Htr II have been built. The physical part of the body is called "bop" or "bop". Htr II's mass occurrence system is composed of two types of occurrence. That is, Htr II BR's leader sequence and fusion The difference between the quality of the product and the quantity of the product is discussed. Protein purification is simplified, and the protein base ends are fused. A large amount of Htr II was dissolved and Ni-NTA Agarose was used to refine it. The first is to create a new environment for the future. A large amount of protein is produced in the same way as Htr II. Now, we can use SR II and Htr II to make 3D crystals.

项目成果

S.Nakatsuka, M.Hayashi, A.Muroyama, M.Otsuka, S.Kozaki, H.Yamada, Y.Moriyama: "D-Aspartate is stored in secretory granules and released through a Ca^<2+>-dependent pathway in a subset of rat pheochromocytoma PC 12 cells"J. Biol. Chem.. 356. 26589-26596 (2

S.Nakatsuka、M.Hayashi、A.Muroyama、M.Otsuka、S.Kozaki、H.Yamada、Y.Moriyama：“D-天冬氨酸储存在分泌颗粒中，并通过 Ca^2 依赖性途径释放

M.Hayashi, M.Otsuka, R.Morimoto, S.Hirota, S.Yatsuhiro, J.Takeda, A.Yamamoto, Y.Moriyama: "Differentiation-associated Na^+-dependent inorganic phosphate cotransporter (DNPI) is a vesicular glutamate transporter in endocrine glutamatergic systems"J Biol Ch

M.Hayashi、M.Otsuka、R.Morimoto、S.Hirota、S.Yatsuhiro、J.Takeda、A.Yamamoto、Y.Moriyama：“分化相关的 Na^ 依赖性无机磷酸盐协同转运蛋白 (DNPI) 是一种囊泡谷氨酸盐

H.Yamada, M.Otsuka, M.Hayashi, K.Hamaguchi, A.Yamamoto, Y.Moriyama: "Ca^<2+>-dependent exocytosis of L-glutamate by αTC6, clonal mouse pancreatic α cells"Diabetes. 50. 1012-1020 (2001)

H.Yamada、M.Otsuka、M.Hayashi、K.Hamaguchi、A.Yamamoto、Y.Moriyama：“αTC6 克隆小鼠胰腺 α 细胞对 L-谷氨酸的 Ca^2+ 依赖性胞吐作用”糖尿病 50。 .1012-1020 (2001)

M.Otsuka: "Determination of ethanol in biological samples by gas chromatography with electron-capture detection"Biol.Pharm.Bull.. 25. 1634-1636 (2002)

M.Otsuka：“通过电子捕获检测气相色谱法测定生物样品中的乙醇”Biol.Pharm.Bull.. 25. 1634-1636 (2002)

I.Lutz, A.Sieg, A.A.Wegener, M.Engelhard, I.Boche, M.Otsuka, D.Oesterhelt, J.Wachtveitl, W.Zinth: "Primary reactions of sensory rhodopsins"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.. 98. 962-967 (2001)

I.Lutz、A.Sieg、A.A.Wegener、M.Engelhard、I.Boche、M.Otsuka、D.Oesterhelt、J.Wachtveitl、W.Zinth：“感觉视紫红质的初级反应”Proc.Natl.Acad.Sci。