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ラボCDベース1細胞アッセイ用ハイスループットスクリーニングシステム

用于实验室基于 CD 的单细胞测定的高通量筛选系统

基本信息

批准号：
19021045
负责人：
久保いづみ
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Soka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

ラボCDはマイクロ流路をシリコン基板に反応性イオンエッチング(Deep-RIE)により形成させて作製した。流路はディスクの中心から外側に向けてジグザグ形に作成した。一枚のディスク上に24本の流路があり、一本の流路に313個のμチャンバーが付いている。チャンバーのサイズは300μm×200μm×46μmのU字型である。チャンバー一つあたりに分離される溶液の体積は約1.5nlである。このラボCDのインレット部分にPCR試薬とサルモネラ菌の混合溶液を1μl入れ、5000rpmで30秒間回転させる事によって細胞単離を行った。その後、連続的にthermal cyclerを用いて95℃で2分の溶菌、続けて95℃で5秒、55℃で10秒、72℃で10秒のサイクルで反応させる事によってPCRを行い、サルモネラ菌固有遺伝子であるinvA遺伝子を増幅し、イメージングアナライザーで蛍光強度を確認した。細胞一個からのPCRが可能か調べるために、PCR試薬中に400cells/μlの濃度でサルモネラ菌を入れ、細胞単離を行った後、溶菌し、PCRを行い、その蛍光強度を確認してみた。その結果、ボアソン分布に依存した細胞数に従った蛍光強度の分布を確認する事ができた。Table1には、それぞれの濃度でのボアソン分布による各μチャンバーに入る細胞の数の確率を示した。このことから、細胞数に応じた蛍光強度になる事が確認された。また、今後の研究においては蛍光強度が2500を越えたものをポジティブとすることに決めた。さらに、大腸菌とサルモネラ菌を100cells/μlの濃度でPCR試薬中に入れたものでもPCRを行った。その結果、200cells/μlのサルモネラ菌のみを入れたPCR試薬の結果よりも、少ない細胞数が確認された。200cells/μlの大腸菌のみを入れたものでは全く蛍光強度が上がらなかったため、大腸菌とサルモネラ菌との間でサルモネラ菌に対しての選択性が確認された。

The CD is formed by the reaction of the substrate to the flow path (Deep-RIE). The flow path is made from the center to the outside. One of them has 24 channels and one of them has 313 channels. 300μm×200μ m×46μm U-shape The volume of the solution is about 1.5nl. The PCR assay for the CD and DNA fragments was performed by injecting 1μl of the mixed solution of the CD and DNA fragments at 5000rpm for 30 seconds. After that, the thermal cycler was used at 95℃ for 2 minutes to dissolve bacteria, at 95℃ for 5 seconds, at 55℃ for 10 seconds, and at 72℃ for 10 seconds. The reaction time was determined by PCR, and the inherent gene of bacteria was increased. The light intensity was confirmed. Cell PCR may be adjusted to a concentration of 400cells/μl in PCR assay, cell isolation, lysis, PCR, and light intensity confirmation. The distribution of light intensity depends on the number of cells. Table1 shows the exact number of cells in each cell. The number of cells and the intensity of light are confirmed. In the future, the light intensity will be 2500. The concentration of Escherichia coli and Escherichia coli was 100 cells/μl, and the PCR assay was performed. The results of the PCR assay were confirmed by 200cells/μl and the number of cells. 200cells/μl of E. coli and its selectivity was confirmed.