1細胞蛍光検出技術を用いた腫瘍内がん特異的免疫細胞の遺伝子スクリーニング法の開発

利用单细胞荧光检测技术开发瘤内癌症特异性免疫细胞基因筛查方法

• 批准号: 19021050
• 负责人: 秋山 靖人
• 金额: $ 3.26万
• 依托单位: Shizuoka Cancer Center Research Institute
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19021050/
• 关键词: 1細胞蛍光検出; 免疫細胞; 遺伝子クローニング; 遺伝子スクリーニング

平成20年度は,これまでに行ってきた1細胞レベルでの免疫細胞の検出および免疫関連遺伝子クローニング技術の精度と効率を向上させることを目的とした技術的な改良を継続して行っている。1個のB細胞から遺伝子クローニングを行う場合、特異的なIgG抗体を持つB細胞を同定する染色法の精度とPCR法による1細胞遺伝子増幅の効率に問題点があった。最初のB細胞の染色同定の精度については、GST標識組換えタンパク+Alexa標識抗GST抗体およびPE標識抗ヒトIgG抗体の使用にて改善された。次に1細胞遺伝子増幅の効率については、RTの簡略化、2段階(nested)PCR法などの工夫により、PCR増幅の効率が改善された。抗体遺伝子は、IgH(IgG)鎖遺伝子のPCR増幅に成功した同一の1細胞より同様にIgL(IgG)鎖遺伝子の増幅を行った。当初Primary B細胞の抗体遺伝子の増幅は従来法では困難であったが、この技術改良により不死化をしていない通常のB細胞1個からも抗体遺伝子クローニングが可能となった。IgG抗体遺伝子のコピー数を評価できるリアルタイム定量PCR法では、EBウイルスにて不死化したB細胞においてIgG抗体遺伝子は、通常のB細胞に比べて10倍以上のコピー数の増幅(平均110/細胞)が確認された。Primary B細胞の1細胞あたりの抗体遺伝子コピー数は、10個以下と考えられた。さらに本年度は、抗体遺伝子を取得する症例を選別するため、抗原特異的な血清抗体価を定量・標準化する測定技術を開発し、あらかじめ標的となる抗原に対する抗体価の高い症例由来のB細胞を利用することが可能となっている。これらの基盤技術を活用し、得られたヒト抗体遺伝子配列より組み換え抗体を作製し、抗体の機能的な評価を行う予定である。

20 year は pp.47-53, こ れ ま で に line っ て き た 1 cell レ ベ ル で の immune cells の 検 out お よ び immune masato even heritage 伝 son ク ロ ー ニ ン グ technology の precision と を sharper rate upward さ せ る こ と を purpose と し た improved を from な 継 続 し て line っ て い る. の 1 B cells か ら heritage 伝 son ク ロ ー ニ ン グ を う occasions, specific な IgG antibody を hold つ B cells を be す る staining の precision と PCR method に よ る 1 cells survived 伝 child rights の picture sharper rate に problem point が あ っ た. Initial の B cells の dyeing with fixed の precision に つ い て は, GST logo in え タ ン パ ク + Alexa logo GST antibody resistance お よ び PE logo ヒ resistance ト IgG antibody の use に て improve さ れ た. Time に 1 cells survived 伝 child rights の picture sharper rate に つ い て は, RT の brief paragraph, two order (nested PCR method な ど の time に よ り, PCR raised の が improve working rate さ れ た. Antibody heritage 伝 は, IgH (IgG) lock heritage 伝 son の PCR rights of に successful し た same の 1 cell よ り with others に IgL (IgG) lock heritage 伝 son の raised painting line を っ た. Son had Primary B cells の antibody heritage 伝 の rights of は 従 to method で は difficult で あ っ た が, こ の technology improved に よ り die change を し て い な い の B cells usually 1 か ら も antibody heritage 伝 son ク ロ ー ニ ン グ が may と な っ た. IgG antibody heritage 伝 son の コ ピ ー number を review 価 で き る リ ア ル タ イ ム quantitative PCR method で は, EB ウ イ ル ス に て die change し た B cells に お い て IgG antibody heritage 伝 は, usually の B cell に べ て 10 times more の コ ピ ー number の rights (an average of 110 / cell) が picture confirm さ れ た. For Primary B cells <s:1> 1, the number of 伝 offspring コピ of <s:1> antibodies in あた <s:1> <s:1> <s:1> cells <e:1> is 伝. If the number is less than 10, と tests えられた. さ ら に は this year, antibody heritage 伝 child obtain を す る cases を choose don't す る た め, antigen specific な serum antibody 価 を quantitative, standardized す る determination technology を open 発 し, あ ら か じ め mark と な る antigen に す seaborne る antibody 価 の cases high い origin の を B cells using す る こ と が may と な っ て い る. こ れ ら の し l20 を base plate technology, and ら れ た ヒ ト antibody heritage 伝 with sequence よ み り group in え antibody を な evaluation of し, antibody の functional 価 を line う designated で あ る.

项目成果

Characterization of a MAGE-1-derived HLA-A24 Epitope-specific CTL Line from a Japanese Metastatic Melanoma Patient

来自日本转移性黑色素瘤患者的 MAGE-1 衍生 HLA-A24 表位特异性 CTL 系的表征

• 发表时间: 2009
• 期刊: Anticancer Res 29
• 作者: M. Nakamoto;A. Sekiguchi;S. Inoue;Akiyama Y et al.
• 通讯作者: Akiyama Y et al.

1細胞蛍光検出技術を用いたがん特異的免疫細胞の遺伝子スクリーニング法の開発

利用单细胞荧光检测技术开发癌症特异性免疫细胞的基因筛查方法

• 发表时间: 2008
• 作者: 瀧川雅子;秋山靖人 他;関口章;A. Sekiguchi;秋山靖人;A. Sekiguchi;M. Ichinohe;秋山靖人 他
• 通讯作者: 秋山靖人 他

Preparation of human immune T Cells containing iron-oxide nanoparticles for magnetically mediated immunotherapy

含有氧化铁纳米粒子的人免疫T细胞的制备用于磁介导免疫治疗

• 发表时间: 2008
• 期刊: Biotecnol Bioeng 101(6):1123-1128,2008 101
• 作者: Iida H;Akiyama Y et al.
• 通讯作者: Akiyama Y et al.

Development of single cell-based screening method for cancer-specific immune cell-related genes

开发基于单细胞的癌症特异性免疫细胞相关基因筛选方法

• 发表时间: 2009
• 作者: Kutsuzawa K;Akiyama Y;et. al.;V.Ya.Lee;秋山靖人 他;K. Takeuchi;H. Tanaka;秋山靖人 他
• 通讯作者: 秋山靖人 他

Gene expression analysis from sngle-cell by using microfluidic device equipped with micromesh

使用配备微网的微流体装置进行单细胞基因表达分析

• 发表时间: 2009
• 作者: Kutsuzawa K;Akiyama Y;et. al.;V.Ya.Lee;秋山靖人 他;K. Takeuchi;H. Tanaka;秋山靖人 他;新垣篤史 他
• 通讯作者: 新垣篤史 他