1細胞蛍光検出技術を用いた腫瘍内がん特異的免疫細胞の遺伝子スクリーニング法の開発

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平成20年度は,これまでに行ってきた1細胞レベルでの免疫細胞の検出および免疫関連遺伝子クローニング技術の精度と効率を向上させることを目的とした技術的な改良を継続して行っている。1個のB細胞から遺伝子クローニングを行う場合、特異的なIgG抗体を持つB細胞を同定する染色法の精度とPCR法による1細胞遺伝子増幅の効率に問題点があった。最初のB細胞の染色同定の精度については、GST標識組換えタンパク+Alexa標識抗GST抗体およびPE標識抗ヒトIgG抗体の使用にて改善された。次に1細胞遺伝子増幅の効率については、RTの簡略化、2段階(nested)PCR法などの工夫により、PCR増幅の効率が改善された。抗体遺伝子は、IgH(IgG)鎖遺伝子のPCR増幅に成功した同一の1細胞より同様にIgL(IgG)鎖遺伝子の増幅を行った。当初Primary B細胞の抗体遺伝子の増幅は従来法では困難であったが、この技術改良により不死化をしていない通常のB細胞1個からも抗体遺伝子クローニングが可能となった。IgG抗体遺伝子のコピー数を評価できるリアルタイム定量PCR法では、EBウイルスにて不死化したB細胞においてIgG抗体遺伝子は、通常のB細胞に比べて10倍以上のコピー数の増幅(平均110/細胞)が確認された。Primary B細胞の1細胞あたりの抗体遺伝子コピー数は、10個以下と考えられた。さらに本年度は、抗体遺伝子を取得する症例を選別するため、抗原特異的な血清抗体価を定量・標準化する測定技術を開発し、あらかじめ標的となる抗原に対する抗体価の高い症例由来のB細胞を利用することが可能となっている。これらの基盤技術を活用し、得られたヒト抗体遺伝子配列より組み換え抗体を作製し、抗体の機能的な評価を行う予定である。