細菌の多剤耐性化に関与するインテグラーゼの結晶構造と基質-酵素相互作用の解析

细菌多药耐药性整合酶晶体结构及底物-酶相互作用分析

• 批准号: 19041061
• 负责人: 山口 佳宏
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19041061/
• 关键词: 多剤耐性菌; 遺伝子組み換え酵素; X線結晶構造解析; 速度論的解析; 酵素; 熱力学的解析; 核酸認識; インテグロン

グラム陰性細菌において、プラスミド性の多剤耐性菌の出現は、薬剤耐性遺伝子の拡散という観点で臨床の現場で問題となっている。このプラスミド上には、薬剤耐性遺伝子の組み換え反応を触媒しているIntegron Integrase(IntI)をコードした遺伝子があり、IntIはプラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子を切り離し、転写活性を高めるためにプロモーター付近に組み込んだり、染色体に組み込む反応を触媒することで、多剤耐性菌の拡散が危惧される酵素である。本研究では、臨床において頻繁に単離されるIntI1を研究対象として、IntI1の精製を行い、X線結晶構造解析を含む物理化学的な手法を用いて、構造機能解析を行うことが目的である。また本研究は、プラスミド性多剤耐性菌の検出法開発において重要である。平成20年度は、pCold発現系で大腸菌内で発現させたN末にHis-Tagを融合させたHis-IntI1の精製条件を検討した。His-IntI1はリン酸緩衝液(pH7.0)中では、His-Tagと親和性があるNiカラムには結合しにくいことがわかった。またHis-IntI1は、Tris緩衝液(pH7.5)またはHepes緩衝液(pH7.5)中において、Niカラムで分離・抽出を行ったHis-IntI1溶液は、260nmに極大吸収があることから、核酸と複合体を形成したHis-IntI1が精製されていることがわかった。さらにHis-IntI1は、EDTA存在下において、大腸菌の染色体DNAを切断する機能を有することがわかった。

The emergence of multi-drug resistant bacteria, the dispersion of drug-resistant bacteria, and clinical field problems In this case, the resistance gene is isolated, the gene activity is high, the gene composition is high, the chromosome composition is high, the gene composition is high, the gene promoter is high, and the multi-resistant bacteria are at risk. This study is aimed at the study of clinical and functional analysis of IntI1, purification of IntI1, X-ray crystallographic analysis, physicochemical methods, and functional analysis. This study is very important for the development of a new method for the identification of multi-resistant bacteria. In 2010, the purification conditions of His-Tag fusion and His-Int1 in Escherichia coli were discussed. His-Tag and affinity Ni His-IntI1 buffer solution (pH 7.5) and Hepes buffer solution (pH 7.5) were used for isolation and extraction. His-IntI1 solution was used for maximum absorption at 260nm. Nucleic acid complex was formed. In the presence of EDTA, His-Int I 1 can cut off the chromosome DNA of Escherichia coli.

项目成果

Purification of Integron Integrase (IntI1) that is responsible for mobility and integration of antibiotic resistance genes in Gram-negative bacteria

整合子整合酶 (IntI1) 的纯化，负责革兰氏阴性细菌中抗生素抗性基因的移动和整合

• 发表时间: 2008
• 作者: 辨野義己;ら (分担);Osumi D;黒木由夫;黒木由夫;Nie X;Inoue A;Kiyokawa T;Yamazoe M;黒木由夫;黒木由夫;黒木 由夫;Kuroki Y.;Matsushima N.;Takahashi T.;Sano H.;Sawada K;Ariki S;三上智子;Nishitani C;Takahashi M;黒木由夫;Ariki S;Sawada K;黒木由夫;澤田格;西谷千明;有木茂;山添雅己;Sawada K.;Nie X.;Yamazoe M.;Mikami T.;Nishitani C.;Shimizu T.;Kuroki Y.;Nishitani C.;Kuronuma K.;Mitsuzawa H.;Yamaguchi Y.(第一著者)
• 通讯作者: Yamaguchi Y.(第一著者)

Expression and purification of Integron Integrase (IntI1) that is responsible for multiple antibiotic resistance in bacteria

负责细菌多重抗生素耐药性的整合子整合酶 (IntI1) 的表达和纯化

• 发表时间: 2007
• 作者: 辨野義己;ら (分担);Osumi D;黒木由夫;黒木由夫;Nie X;Inoue A;Kiyokawa T;Yamazoe M;黒木由夫;黒木由夫;黒木 由夫;Kuroki Y.;Matsushima N.;Takahashi T.;Sano H.;Sawada K;Ariki S;三上智子;Nishitani C;Takahashi M;黒木由夫;Ariki S;Sawada K;黒木由夫;澤田格;西谷千明;有木茂;山添雅己;Sawada K.;Nie X.;Yamazoe M.;Mikami T.;Nishitani C.;Shimizu T.;Kuroki Y.;Nishitani C.;Kuronuma K.;Mitsuzawa H.;Yamaguchi Y.(第一著者);Yamaguchi Y. (第一著者)
• 通讯作者: Yamaguchi Y. (第一著者)