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大腸菌ゲノム情報を活用したシステインの代謝制御機構の解明と発酵生産への応用

利用大肠杆菌基因组信息阐明半胱氨酸的代谢控制机制及其在发酵生产中的应用

基本信息

批准号：
20018018
负责人：
高木博史
金额：
$ 4.61万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20018018/
关键词：
ゲノム情報システイン発酵スルホシステイン

项目摘要

大腸菌にはシステイン(Cys)をO-acetylserine sulfhydrylase A(OASS-A)によりO-acetylserine(OAS)とSO_4^<2->から合成する経路1と、OASS-BによりOASとS_2O_3^<2->から生成するsulfocysteineを介して合成する経路2が存在する。これまでに経路1の制御機構の解除を中心としたCys生産菌の育種が続けられてきたが、経路1だけでは合成系の強化にも限界がある。一方、経路2はsulfocysteineからCysへの還元に関わる酵素やその制御機構が未解明であるが、経路1と比べ硫黄同化経路でのエネルギー消費が少ないため、その知見を発酵生産へ応用することで、Cys生産性の向上が期待できる。まず、経路1のOASS-A遺伝子(cysK)と経路2のOASS-B遺伝子(cysM)を破壊した二重欠損株を作製したところ、予想通りCys要求性を示したことから、大腸菌のCys生合成経路には1と2しか存在せず、二重欠損株ライブラリーを用いた解析が可能であることが判明した。現在、Keio collectionとcysK破壊株を接合させた二重欠損株ライブラリーを用いて、Cys要求を示す菌株を単離し、新規経路に関与する遺伝子の探索を行なっている。また、すでに高等動物において、glutaredoxin(Grx)がsulfocysteineをCysに還元する反応を触媒することが報告されている。そこで、大腸菌に存在する酸化還元酵素がsulfocysteineからCysへの還元活性を示すかどうかについて評価した。9種類の酸化還元酵素にHisタグを融合した組換え酵素を精製し、酵素活性を測定した。その結果、Grx1,2,3はsulfbcysteineのCysへの還元を触媒することが明らかになった。さらに、in vivoでの効果を確認するために、これら酸化還元酵素をそれぞれ過剰発現させたCys生産菌を構築し、S_2O_3^<2->を硫黄源としたCys生産実験を行った。その結果、Grx1及びGrxと相同性の高い還元酵素NrdHの過剰発現株では、Cys生産量が有意に増加(20-40%)しており、これらの還元酵素の過剰発現がCys発酵生産に有効であることが示された。

E. coli Cys O-acetylserine sulfhydrylase A(OASS-A) pathway <2->1 and OASS-B pathway 2 exist between OAS and S_2O_3<2->. In this case, the control mechanism of circuit 1 is released from the center and the breeding of Cys producing bacteria is restricted. On the other hand, the control mechanism of enzymes related to the conversion of Cys to sulfur is not yet understood. On the other hand, the control mechanism of enzymes related to the conversion of Cys to sulfur is not yet understood. On the other hand, the control mechanism of sulfur assimilation is not yet understood. On the other hand, the control mechanism of enzymes related to the conversion of Cys to sulfur is not yet understood. On the other hand, the control mechanism of Cys productivity is expected to be improved. The OASS-A gene (cysK) of circuit 1 and the OASS-B gene (cysM) of circuit 2 are broken down and double defective strains are controlled. It is necessary to understand the requirements of Cys. The Cys biosynthesis circuit of Escherichia coli is broken down and double defective strains are analyzed. Now, Keio collection and cysK strain conjugation, double loss strain isolation, Cys requirements, strain isolation, new circuit, and genetic exploration are under way. The higher animals, the glutaredoxins (Grx), the sulfocysteines, the reducers, the catalysts. The presence of acid-reducing enzymes in E. coli and the activity of acid-reducing enzymes in E. coli are evaluated. 9 Types of Acidifying Enzymes: Fusion, Purification, Enzyme Activity The results, Grx1,2,3 and sulfbcystine of the Cys are the same as the catalyst. In vivo, the production of Cys was confirmed. The production of Cys by S_2O_3 <2->was confirmed. As a result, Grx1 and Grx2 share the same high level of reductase NrdH and Cys production increased intentionally (20-40%).