人工細胞モデル構築のための膜蛋白質複合システム機能の再構成

重建膜蛋白复合体系统功能以构建人工细胞模型

• 批准号: 20034029
• 负责人: 湊元 幹太
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Mie University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20034029/
• 关键词: リポソーム; 人工細胞; 膜融合; バキュロウイルス; プロテオリポソーム; 膜蛋白質; GPCR; シグナル伝達; ベシクル; 情報伝達

人工細胞モデル構築のための膜蛋白質複合システム機能の統合的再構成法の確立をめざし,まず基幹的シグナル伝達経路である『G蛋白質共役型受容体(GPCR)/促進性3量体G蛋白質(Gs)/アデニル酸シクラーゼ(ADCY)経路』に与る膜蛋白質群機能を巨大リポソーム(Giant Unilamellar Vesicle ; GUV)膜へ再構成することを目標として,研究した。そして,バキュロウイルス/昆虫細胞遺伝子発現系とそれによって得た組換え膜蛋白質要素搭載出芽ウイルス(BV)とGUVとの膜融合を利用して経路因子を組み込む,巨大プロテオリポソーム作製法をほぼ確立できた。具体的には次の通りである。前年度まではGUVと共沈する画分中で,上記因子を抗体検出しその組込み確認していた。本年度は各膜蛋白質に特異的に結合する蛍光標識リガンド(ホルモンなど)でGUV膜を可視化した。これにより本手法でリポソーム膜に組み込まれた膜蛋白質の機能保持が強く示唆された。さらに経路機能の発現をGUV内でのcAMP産生により検出した。当初,顕微鏡による直接可視化を試みたが困難であったため,GUVの特性を活かしたスピンダウンアッセイを開発した。このアッセイでは,ADCYの基質類を封入したGUVを,各因子を含むBVと融合させた後,穏やかな遠心で巨大プロテオリポソームのみ回収,一定時間cAMP合成反応をさせてから副産物のピロリン酸量を測定する。その結果,GUV上で,Forskolin, SQ22536によるADCYの特異的活性亢進,阻害をそれぞれ検出した。さらにGs/ADCYを組み込んだGUVでも,GTP, GTPγSによるADCYの特異的活性化を実現し,経路の一部が繋がった。本手法は形質膜上の膜蛋白質一般への適用が可能と期待されることから,本研究により膜蛋白質複合システム機能再構成の汎用手法が確立できたと言える。

The aim of this study is to establish a method for reconstructing membrane protein complex functions of artificial cell structures, including the basic stem system pathway of "G protein co-active receptor (GPCR)/promoter 3-mer G protein (Gs)/promoter 3-mer G protein complex (ADCY) pathway" and the membrane protein complex function of "Giant Unilamellar Vesicle ; GUV" membrane re-construction. In addition, the development of insect cell gene expression system and membrane protein elements-carrying budding (BV) and GUV membrane fusion system was established by using the pathway factor. Specific. In the previous year, the GUV and co-precipitation were analyzed, and the above factors were detected and confirmed. This year, the GUV film was visualized by light identification for specific binding to each membrane protein. This method allows membrane protein to function efficiently and efficiently. cAMP production in the GUV is detected during the development of circuit functions. At the beginning, it was difficult to visualize the GUV directly. The matrix of ADCY was encapsulated in GUV, and the factors included BV and fusion. After fusion, the concentration of cAMP was determined in a certain period of time. As a result,Forskolin, SQ22536 exhibited specific hyperactivity on GUV, and its inhibition was detected. The specific activation of Gs/ADCY in GUV, GTP, GTPγS is realized, and part of the loop is closed. This study aims to establish a general method for the reconstruction of membrane protein complex functions.

项目成果

Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar

• DOI: 10.1016/j.colsurfb.2008.09.023
• 发表时间: 2009-01-01
• 期刊: COLLOIDS AND SURFACES B-BIOINTERFACES
• 影响因子: 5.8
• 作者: Tsumoto, Kanta;Matsuo, Hideki;Yoshimura, Tetsuro
• 通讯作者: Yoshimura, Tetsuro

人工細胞研究における巨大リポソーム

人工细胞研究中的巨型脂质体

• 发表时间: 2010
• 期刊: 人工血液 18(印刷中)
• 作者: Ozawa T.;et.al.;湊元幹太
• 通讯作者: 湊元幹太

細胞の機能再構成と模倣～人工細胞モデルをつくるには～

细胞的功能重构和模仿-如何创建人工细胞模型-

• 发表时间: 2009
• 作者: 小松佑規;三浦陽子;濱田勉;高木昌宏;湊元幹太
• 通讯作者: 湊元幹太

情報伝達システムをもった巨大プロテオリポソーム作製の試み

尝试制造具有信息传输系统的巨型蛋白脂质体

• 发表时间: 2009
• 作者: 水口知明;他
• 通讯作者: 他

G protein Coupled Receptors (GPCRs) Reconstituted on Recombinant Proteoliposomes using Baculovirus-Liposome Membrane Fusion

使用杆状病毒-脂质体膜融合在重组蛋白脂质体上重建 G 蛋白偶联受体 (GPCR)

• 发表时间: 2009
• 作者: Tsumoto;K.;et al.
• 通讯作者: et al.