膜内在性ADP-リボシル転移酵素による刺激伝達の調節に関する研究

細胞膜に内在するADP-リボシル転移酵素と同アクセプターの確認-ラット脳より単離した膜画分と[^<32>P]NADを反応させることにより、膜結合性ADP-リボシル転移酵素と、この酵素によってADP-リボシル化を受けるアクセプター蛋白質の存在を確認した。この際、細胞内で圧倒的に活性の強いポリ(ADP-リボース)合成酵素によるADP-リボシル化と区別する必要があったが、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のオートラジオグラフィのバンドの位置(42kDaと39kDa)、ポリ(ADP-リボース)合成酵素阻害剤(3-アミノベンズアミド、カルサラム)の効果およびADP-リボシル-蛋白質結合の安定性(中性ヒドロキシラミン中で半減期約1時間)により明瞭にして区別できることを示した。アクセプターとしては、SDSゲル上の見掛けの分子量より、いわゆるGTP結合蛋白質群のGiα、Goαの可能性が強く示唆された。2.各種ADP-リボシル転移酵素の阻害剤の発見-約100種類の有機化合物について、ポリ(ADP-リボース)合成酵素(コウシ胸腺から精製)とモノマー特異的ADP-リボシル転移酵素(七面鳥赤血球およびニワトリ肝臓核より精製)に対する阻害対策を、in vitro反応系を用いて検討した。その結果、従来知られたニコチンアミドやベンズアミドの誘導体の他に、キノリン、クマリン、カルサラム、フタルヒドラジド、ベンゾキノンなど各種構造の化合物多数が、それぞれの酵素に特異的な(あるいは共通な)強い阻害効果をもつことを見出した。3.今後の研究計画-当初の方針通り、ADP-リボシル転移酵素とアクセプターを膜から可溶化し、精製して、酵素学的諸性質を明らかにするとともに、アデニルシクラーゼ系と組み合わせて、刺激伝達の調節機序を解明することが重要で、上記成果によりその基礎が確立された。

細胞膜に内在するADP-リボシル転移酵素と同アクセプターの確認-ラット脳より単離した膜画分と[^<32>P]NADを反応させることにより、膜結合性ADP-リボシル転移酵素と、この酵素によってADP-リボシル化を受けるアクセプター蛋白質の存在を確認した。この際、細胞内で圧倒的に活性の強いポリ(ADP-リボース)合成酵素によるADP-リボシル化と区別する必要があったが、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のオートラジオグラフィのバンドの位置(42kDaと39kDa)、ポリ(ADP-リボース)合成酵素阻害剤(3-アミノベンズアミド、カルサラム)の効果およびADP-リボシル-蛋白質結合の安定性(中性ヒドロキシラミン中で半減期約1時間)により明瞭にして区別できることを示した。アクセプターとしては、SDSゲル上の見掛けの分子量より、いわゆるGTP結合蛋白質群のGiα、Goαの可能性が強く示唆された。2.各種ADP-リボシル転移酵素の阻害剤の発見-約100種類の有機化合物について、ポリ(ADP-リボース)合成酵素(コウシ胸腺から精製)とモノマー特異的ADP-リボシル転移酵素(七面鳥赤血球およびニワトリ肝臓核より精製)に対する阻害対策を、in vitro反応系を用いて検討した。その結果、従来知られたニコチンアミドやベンズアミドの誘導体の他に、キノリン、クマリン、カルサラム、フタルヒドラジド、ベンゾキノンなど各種構造の化合物多数が、それぞれの酵素に特異的な(あるいは共通な)強い阻害効果をもつことを見出した。3.今後の研究計画-当初の方針通り、ADP-リボシル転移酵素とアクセプターを膜から可溶化し、精製して、酵素学的諸性質を明らかにするとともに、アデニルシクラーゼ系と組み合わせて、刺激伝達の調節機序を解明することが重要で、上記成果によりその基礎が確立された。