イノシトール1、4、5-三燐酸によるCa^<2+>動員機構に関する生化学的研究

イノシトール1、4、5-三燐酸(IP_3)は小胞体の貯蔵Ca^<2+>を放出することにより情報伝達の一翼を担っている。しかしながらこの機構の物質的基盤は現在まで得られていない。本研究では小胞体上のIP_3受容体を同定することを目的とした。そのためIP_3のアジド誘導体を合成して用いた。アジドサリチル酸とβ-アラニンからアジドサリチルβ-アラニン(ASβA)を合成した。クロラミンTを用いて^<125>Iを導入し、(^<125>I-ASβA)、そしてカルボニルジイミダゾールを触媒としてIP_3との縮合反応を行ない、IP_3〔^<125>I〕ASβAを得た。サポニン処理マクロファージをIP_3〔^<125>I〕ASβAとともに紫外線照射し、SDS電気泳動、オートラジオグラフィーによりIP_3結合蛋白の同定を行ない分子量50K、27K、18KDaの三種の蛋白が強く標識されたのを認めた。そしてこれらはいずれも過剰のIP_3の共存によりラベリングが抑制された。IP_3認識蛋白としてIP_3ホスファターゼ、IP_3-キナーゼ、そして小胞体上の受容体の三種の存在がこれまでに知られている。後二者の間にはKm値、基質特異性に類似性があるためIP_33キナーゼの精製からIP_3によるCa^<2+>放出の物質的基盤を得る手掛りになると考え着手した。ブタ大動脈平滑筋を用いて可溶性分画と膜分画を得、酵素活性を調べると90%以上の活性が可溶性分画に認められた。この酵素活性は遊離Ca^<2+>濃度に依存して増大し、W-7などのカルモジュリン阻害剤により抑制された。硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィーによりカルモジュリンの混入をなくすことにより酵素活性はCa^<2+>感受性を失ったが、外因性にカルモデュリンを添加すると再びCa^<2+>感受性を回復した。さらに各種クロマトグラフィーによりSDS電気泳動上単一蛋白にまで精製した。精製酵素は93KDaの単一分子でカルモデュリンとのストイキオミトリーは1:1であった。

イノシトール1、4、5-三燐酸(IP_3)は小胞体の貯蔵Ca^<2+>を放出することにより情報伝達の一翼を担っている。しかしながらこの機構の物質的基盤は現在まで得られていない。本研究では小胞体上のIP_3受容体を同定することを目的とした。そのためIP_3のアジド誘導体を合成して用いた。アジドサリチル酸とβ-アラニンからアジドサリチルβ-アラニン(ASβA)を合成した。クロラミンTを用いて^<125>Iを導入し、(^<125>I-ASβA)、そしてカルボニルジイミダゾールを触媒としてIP_3との縮合反応を行ない、IP_3〔^<125>I〕ASβAを得た。サポニン処理マクロファージをIP_3〔^<125>I〕ASβAとともに紫外線照射し、SDS電気泳動、オートラジオグラフィーによりIP_3結合蛋白の同定を行ない分子量50K、27K、18KDaの三種の蛋白が強く標識されたのを認めた。そしてこれらはいずれも過剰のIP_3の共存によりラベリングが抑制された。IP_3認識蛋白としてIP_3ホスファターゼ、IP_3-キナーゼ、そして小胞体上の受容体の三種の存在がこれまでに知られている。後二者の間にはKm値、基質特異性に類似性があるためIP_33キナーゼの精製からIP_3によるCa^<2+>放出の物質的基盤を得る手掛りになると考え着手した。ブタ大動脈平滑筋を用いて可溶性分画と膜分画を得、酵素活性を調べると90%以上の活性が可溶性分画に認められた。この酵素活性は遊離Ca^<2+>濃度に依存して増大し、W-7などのカルモジュリン阻害剤により抑制された。硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィーによりカルモジュリンの混入をなくすことにより酵素活性はCa^<2+>感受性を失ったが、外因性にカルモデュリンを添加すると再びCa^<2+>感受性を回復した。さらに各種クロマトグラフィーによりSDS電気泳動上単一蛋白にまで精製した。精製酵素は93KDaの単一分子でカルモデュリンとのストイキオミトリーは1:1であった。