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イノシトール1、4、5-三燐酸によるCa^<2+>動員機構に関する生化学的研究

肌醇1,4,5-三磷酸钙^2+动员机制的生化研究

基本信息

批准号：
63641528
负责人：
古賀敏生
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

イノシトール1、4、5-三燐酸(IP_3)は小胞体の貯蔵Ca^<2+>を放出することにより情報伝達の一翼を担っている。しかしながらこの機構の物質的基盤は現在まで得られていない。本研究では小胞体上のIP_3受容体を同定することを目的とした。そのためIP_3のアジド誘導体を合成して用いた。アジドサリチル酸とβ-アラニンからアジドサリチルβ-アラニン(ASβA)を合成した。クロラミンTを用いて^<125>Iを導入し、(^<125>I-ASβA)、そしてカルボニルジイミダゾールを触媒としてIP_3との縮合反応を行ない、IP_3〔^<125>I〕ASβAを得た。サポニン処理マクロファージをIP_3〔^<125>I〕ASβAとともに紫外線照射し、SDS電気泳動、オートラジオグラフィーによりIP_3結合蛋白の同定を行ない分子量50K、27K、18KDaの三種の蛋白が強く標識されたのを認めた。そしてこれらはいずれも過剰のIP_3の共存によりラベリングが抑制された。IP_3認識蛋白としてIP_3ホスファターゼ、IP_3-キナーゼ、そして小胞体上の受容体の三種の存在がこれまでに知られている。後二者の間にはKm値、基質特異性に類似性があるためIP_33キナーゼの精製からIP_3によるCa^<2+>放出の物質的基盤を得る手掛りになると考え着手した。ブタ大動脈平滑筋を用いて可溶性分画と膜分画を得、酵素活性を調べると90%以上の活性が可溶性分画に認められた。この酵素活性は遊離Ca^<2+>濃度に依存して増大し、W-7などのカルモジュリン阻害剤により抑制された。硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィーによりカルモジュリンの混入をなくすことにより酵素活性はCa^<2+>感受性を失ったが、外因性にカルモデュリンを添加すると再びCa^<2+>感受性を回復した。さらに各種クロマトグラフィーによりSDS電気泳動上単一蛋白にまで精製した。精製酵素は93KDaの単一分子でカルモデュリンとのストイキオミトリーは1:1であった。

1, 4, 5-triphosphoric acid (IP_3) is a key component of cellular Ca ~(2+) storage. The substrate of the substance of the mechanism is now in the process of being transformed. The purpose of this study is to determine the identity of IP_3 receptors on small cells. Sōta IP_3's aluminum inducer was synthesized and used. The combination of α-hydroxy acid and β-hydroxy acid (ASβA) In <125>the case of <125>IP_3, the condensation reaction is carried out in the case of IP_3 [^<125>I] ASβA. The <125>three proteins with molecular weights of 50K, 27K, and 18KDa are strongly identified as IP_3 binding proteins due to the same properties of POSNEN treated Macron-coated IP_3 [^ I] ASβA and ultraviolet irradiation, SDS electrophoresis, and on-chip electrophoresis. In this case, the IP_3 co-existence is suppressed. IP_3 recognizes the existence of three kinds of receptors on small cells, namely IP_3, IP_3 and IP_4. The latter two are related to Km value, matrix specificity, similarity, IP_33, purification, Ca^<2+> emission, and substrate. The soluble fraction was obtained by enzyme activity modulation, and the activity of soluble fraction was more than 90%. The enzyme activity increased depending on the concentration of free Ca^<2+>, and was inhibited by W-7 inhibitors. The enzyme activity is Ca <2 +> sensitivity loss, exogenous Ca <2+> sensitivity addition, and Ca <2+> sensitivity recovery. All kinds of proteins are purified by SDS electrophoresis. Refined enzymes are 93KDa in size.