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多細胞生物進化解明の基盤としての植物不等分裂に関わる遺伝子ネットワークの解明

阐明参与不对称植物分裂的基因网络作为阐明多细胞生物进化的基础

基本信息

批准号：
15011260
负责人：
藤田知道
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15011260/
关键词：
不等分裂細胞極性プロトプラスト再生 RNA干渉 GFP 完全長cDNA 過剰発現

项目摘要

完全長cDNA一過的過剰発現法による植物不等分裂に関わる遺伝子の網羅的単離、機能推定1、ヒメツリガネゴケから単離したプロトプラストの細胞極性形成開始から不等分裂中の過程で,発現している遺伝子群を効率的かつ網羅的に単離するため、この過程の再生細胞を濃縮して回収する方法を検討した。プロトプラストを単離し、培養開始後2-3日目の時点で細胞を回収し、網目サイズ20μmのフィルターで再生中の細胞と死細胞を分ける操作を行った。回収した再生中の細胞はその後も再生を続けていくことを確認し、この操作が再生細胞の成長に及ぼす影響は排除できると考えられた。このようにして回収した細胞からRNAを抽出し、完全長cDNAライブラリーを作成している。2、既存の完全長cDNAライブラリーを対象として本年度新たに約1000cDNAクローンの一過的過剰発現スクリーニングを行った。その結果等分裂や細胞が巨大化する、細胞死を起こすなど様々な再生異常を引き起こす原因遺伝子を見いだした。3、これまでのスクリーニングからあわせて約200cDNAが再生過程に異常を引き起こすことがわかった。これらの表現型の再現性を確認し、細胞極性形成や不等分裂異常に関わると考えられる原因遺伝子を57種類に絞ることができた。これら候補遺伝子の全塩基配列を決定し、配列に基づいて機能の推定を行った。4、57種類の候補遺伝子についてRNA干渉による表現型観察、ならびにcDNAとGFPの融合タンパク質をプロトプラストに一過的に発現させ不等分裂時の融合タンパク質の細胞内局在を調べるスクリーニングを開始した。RNA干渉、GFP融合コンストラクトを個々の候補遺伝子に対して効率よく作成するためGatewayクローニングを利用できるようにした。これらの方法により候補遺伝子をさらに絞りこむ。

A method for the isolation and function estimation of gene networks related to plant anisomy by complete cDNA one-step detection is discussed. 1. A method for the isolation and function estimation of gene networks related to plant anisomy is discussed. The cells were recovered at 2-3 days after culture, and the cells were separated from dead cells at 20μm. In the process of regeneration, the cells are regenerated and the effects of the operation on the growth of the regenerated cells are eliminated. The RNA was extracted from the cells and the cDNA was completely cloned. 2. About 1000 new cDNA fragments were discovered this year. As a result, cell division, cell enlargement, cell death, and abnormal regeneration occur. 3. About 200 cDNAs were regenerated abnormally. The reproducibility of the phenotype was confirmed, the cell polarity was formed, and the abnormal division was examined. The full base alignment of candidate genes is determined, and the base alignment function is estimated. 4.57 kinds of candidate genes are detected in RNA stem cells, phenotypes are detected in cDNA and GFP fusion proteins, and the fusion proteins are detected in the cell at different times of division. RNA stem, GFP fusion gene, and candidate gene. This method is used to test the candidate's identity.