不活性X染色体の高次構造制御に関与する新規因子群とその進化

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申請者の所属する研究室ではこれまで哺乳類細胞DNA複製タイミングのゲノムワイド解析を確立し、分化に伴う発生制御様式を明らかにした。Early SからLate SへのDNA複製タイミング変化は凝縮した核膜周辺ヘテロクロマチン構造の獲得とよく一致し、これがマウスのエピブラスト相当の時期に大量に生じることも明らかにしてきた。その代表例である雌不活性Ｘ染色体のLate S複製タイミング解除を指標にマウス胚性癌細胞MC12を用いたsiRNAスクリーニングを行うことにより、最近４つの新規遺伝子を見出した。当該年度においては、新規に発見した因子のノックアウトMC12細胞をCRISPR/Cas9で作製中であり、それらのうちの一部は既に作成が終了している。CRISPR/Cas9によるノックアウトはRNAの発現量は変化すること無く、蛋白質の発現量のみを下げることが可能である。ゆえに、CRISPR/Cas9でノックアウトしたMC12細胞の不活性Ｘに異常が見られるか否かを解析することで、siRNAスクリーニングで発見した因子が蛋白質としてではなく、RNAとしての機能を持ち得るのかどうかが判定できる。今後は、この細胞をさらにsiRNA処理することで不活性ＸのLate S複製解除の頻度や脱凝縮の度合いをEdU染色法やFISH法で判定しようと試みている。現在は、既に作成が完了した細胞を用いて予備的な実験を行っているところである。