miRNAを指標としたALS患者運動神経細胞でのTDP-43機能喪失仮説の検証

以miRNA为指标验证ALS患者运动神经元TDP-43功能丧失假说

• 批准号: 15K19480
• 负责人: 志賀 篤
• 金额: $ 2.33万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15K19480/
• 关键词: ALS; TDP-43; miRNA

筋委縮性側索硬化症 (ALS) では，運動神経細胞において，核蛋白TDP-43の核内からの消失を認める．よって病態機序として，TDP-43のmRNAやmiRNAに対する機能喪失による運動神経細胞死，が提唱されている．しかし，TDP-43の核内局在が消失したALS患者運動神経細胞にて，TDP-43のRNAに関連する機能が低下しているかは明らかでない．本申請ではmiRNAの安定性を利用し，核内局在の消失したALS患者運動神経細胞でのTDP-43機能を評価することを目的とする．本年度は，運動神経細胞におけるTDP-43機能を反映するmiRNA発現変化の同定を試みた．申請者はすでに，神経系の細胞特異的にTDP-43発現を低下させたTDP-43コンディショナルノックアウトマウスを使用した検討を行っており，野生型に比して，9個のmiRNAで有意な発現変化を確認している．一方，マウスとヒトでは，TDP-43がmiRNA発現に与える影響が異なる可能性がある．そこで本年度は，ヒトiPS細胞より分化させた運動神経細胞を対象とした検討を行うための，分化誘導法の検討を行った．既報に従い分化誘導を行い，結果，運動神経マーカーであるChATやHb9の発現を，RT-PCR法やウェスタンブロット法にて確認した．また，TDP-43遺伝子をノックアウトしたヒト運動神経細胞の作製に備えるため，AAVS1遺伝子座に，ドキシサイクリン誘導性にCas9タンパクを発現するためのカセットを挿入したヒトiPS細胞を樹立し，これが運動神経細胞に分化することを確認した．

Tendon contractile lateral sclerosis (ALS) is a disease characterized by the disappearance of nuclear protein TDP-43 in motor neurons. The TDP-43 mRNA and miRNA are responsible for the loss of function in motor neurons and the development of the disease mechanism. TDP-43 is absent in motor neurons of ALS patients, and TDP-43 RNA is associated with decreased function. The present application evaluates the stability of miRNA and the function of TDP-43 in motor neurons of ALS patients This year, we tried to synchronize miRNA expression and expression by reflecting TDP-43 function in motor neurons. The applicant was able to identify 9 miRNAs that were intentionally expressed in a cell specific TDP-43 gene using a wild-type assay. TDP-43 miRNA occurrence and miRNA influence are different. This year, the iPS cells were differentiated and the motor neurons were studied. The results showed that the expression of ChAT Hb9 was detected by RT-PCR and the expression of ChAT Hb9 was confirmed by RT-PCR. In addition, the TDP-43 gene was found to be able to induce the development of iPS cells and to identify the differentiation of iPS cells in motor neurons.