ゲノム編集技術を用いた甲状腺機能低下症原因遺伝子の新規機能解析系の確立

利用基因组编辑技术建立新型甲状腺功能减退基因功能分析系统

• 批准号: 16K19560
• 负责人: 阿部 清美
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16K19560/
• 关键词: 先天性甲状腺機能低下症; ゲノム編集; 甲状腺ホルモン合成障害; DUOX2; TPO; DUOXA2; FRTL-5細胞

先天性甲状腺機能低下症(CH)は3000-4000出生に1名の頻度で認められる最も高頻度の先天性内分泌疾患である。CHを来す原因に甲状腺ホルモン合成障害があり、原因遺伝子としてDUOX2、DUOXA2、TPOがある。従来の遺伝子変異機能解析は、非甲状腺細胞を用いた一過性強制発現系という非生理的条件下での検討であった。本研究の目的は「内因性甲状腺ホルモン産生機構を利用したin vitroにおける甲状腺ホルモン合成遺伝子の新規機能解析系を樹立すること」である。つまりゲノム編集技術を用いてラット甲状腺濾胞細胞由来培養細胞株FRTL-5（内因性甲状腺分子としてDUOX2、DUOXA2、TPOが発現）の目的遺伝子を破壊したノックアウト(KO)細胞株を樹立し、変異解析系を確立する。この研究により、生体内での甲状腺ホルモン合成分子の働きをin vitroで観察し得る系の樹立を目指したいと考えた。研究計画・方法としてIからVまでを考案した。I.予備実験としてFRTL-5を用い、TSH刺激下でのH2O2産生能、TPO活性を測定する。II. CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いてDuox2 KO-FRTL-5、Duoxa2 KO-FRTL-5、Tpo KO-FRTL-5細胞株を作成する。III. 上記3種類のKO株の表現型の検討を行う。IV．上記3種類のKO株にヒトcDNA発現ベクター（野性型）を導入し、表現型を検討する（救済実験）。V. 上記3種類のKO株ににヒトcDNA発現ベクター（変異型）を導入し、表現型を検討する。H28年4月より本年度の実施目標であるI.、II.を開始した。I. FRTL-5を培養し、野生型FRTL-5による至適細胞数、至適TSH濃度、刺激時間を検討した。細胞を播いた24時間後、TSH 0～100 U/L添加し、添加後Amplex Red試薬を用いてH2O2産生能、TPO活性を測定した。II. CRISPR/Cas9によるゲノム編集を行うため、Duox2 KO-FRTL-5、 Duox2/DuoxA2 KO-FRTL-5のガイドＲＮＡ作成を試みた。I.、II.ともに研究途中であったが、研究代表者留学のため、本科研費による研究継続を断念した。

Congenital hypothyroidism (CH) is the most frequent congenital endocrine disorder among 3000-4000 births. CH comes from the thyroid gland, causes the thyroid gland to synthesize, causes the thyroid gland to synthesize. Analysis of the different functions of thyroid cells and non-thyroid cells under transient stress The purpose of this study is to establish a new functional analysis system for endogenous thyroid hormone production mechanisms in vitro. The target gene of FRTL-5 (endogenous thyroid molecules such as DUOX2, DUOXA2 and TPO) was isolated from cultured thyroid filter cells by means of the gene assembly technique, and a different analysis system was established. This study is aimed at exploring the development of thyroid in vivo. Research plan, methodology, and case studies I. Determination of H2O2 production and TPO activity under TSH stimulation in the presence of FRTL-5. II. The CRISPR/Cas9 gene expression system was developed using Duox2 KO-FRTL-5, Duoxa2 KO-FRTL-5 and Tpo KO-FRTL-5 cell lines. III. The phenotype of the three KO strains described above was investigated. IV. cDNA development of the three KO strains described above was introduced into the wild type, and phenotype analysis was conducted. V. cDNA development of the three KO strains described above is discussed in the introduction and phenotype analysis. H28 April II. Start. I. FRTL-5 culture, wild-type FRTL-5 to the appropriate number of cells, to the appropriate TSH concentration, stimulation time to discuss After 24 hours of cell seeding, TSH 0~100 U/L was added, and H2O2 production and TPO activity were measured by Amplex Red assay. II. CRISPR/Cas9 and Duox2 KO-FRTL-5 were compiled and tested. I.、II. Research on the way, research representatives to study abroad, this research fee, research and development