Crispr/Cas9を用いたプロモーター挿入による過剰発現系構築と血管研究応用

Crispr/Cas9启动子插入过表达系统的构建及其在血管研究中的应用

• 批准号: 26860553
• 负责人: 松永 太一
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26860553/
• 关键词: CRISPR/Cas9; マウスES細胞; 血管; 分化

標的遺伝子の過剰発現や欠損に伴う表現型の解析は、遺伝子工学の強力な実験ツールである。しかし、過剰発現するためには、発現ベクター作製が必須であるが、作製の困難な遺伝子が存在する。本研究では、標的遺伝子のコード領域上流に、プロモーター配列を挿入することによって、ゲノム配列を生かし、これまで過剰発現等が困難であった様々な遺伝子の機能を簡便に解析できる手法の確立を目指した。まず、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術に着目し、標的遺伝子として血管内皮増殖因子Ⅱ型受容体をターゲットとしたGuide RNAおよびTargeting Vectorを作製した。このGuide RNAおよびTargeting Vectorを用いて薬剤誘導性TRE-CMVプロモーター配列を標的遺伝子のコード領域上流に挿入したマウスES細胞を樹立した。次に、挿入したプロモーターの活性化によって発現が誘導された標的遺伝子の機能を血管内皮細胞分化系にて解析した。その結果、プロモーターの活性化によって血管内皮細胞分化が促進したことから標的遺伝子が正しく機能したことを明らかにした。さらに、プロモーターの不活性化によって標的遺伝子のノックアウトの表現型を再現できることを見出した。以上のように、in vitroにおいて標的遺伝子のノックアウトおよび過剰発現を簡便に行える手法を確立した。この技術の活用により様々な標的遺伝子の機能解析に貢献できるものと考える。また、これらの研究結果の一部について専門学術集会において発表を行った。

The residual 伝 sub-<s:1> of the subject matter is overly developed, や is damaged, に is accompanied by う phenotype <s:1> analysis <e:1>, residual 伝 sub-engineering <s:1> strong な experience, である である である. し か し, turning 発 now す る た め に は, 発 ベ ク タ ー cropping が must で あ る が, difficulty for making の な heritage 伝 son が exist す る. This study で は, mark but 伝 の コ ー ド upper-class に, プ ロ モ ー タ ー match column を scions into す る こ と に よ っ て, ゲ ノ ム match column を raw か し, こ れ ま で before turning 発 now が difficulties such as で あ っ た others 々 な posthumous son 伝 の function を simple analytical で に き る gimmick の establish を refers し た. ま ず, CRISPR/Cas9 シ ス テ ム に よ る ゲ ノ compiling technology ム に し, mark but 伝 son と し type て endothelial factor Ⅱ rights colonization by let body を タ ー ゲ ッ ト と し た Guide RNA お よ び Targeting Vector を cropping し た. こ の Guide RNA お よ び Targeting Vector を with い て 薬 tonic induced TRE - CMV プ ロ モ ー タ ー match column を mark heritage 伝 son の コ ー ド field upper に scions into し た マ ウ ス を ES cells establish し た. に, scions into し た プ ロ モ ー タ ー の activeness に よ っ て 発 now が induced さ れ た mark heritage 伝 son を endothelial cell differentiation is の function に て parsing し た. そ の results, プ ロ モ ー タ ー の activeness に よ っ て が promote vascular endothelial cell differentiation し た こ と か ら mark heritage 伝 son が is し く function し た こ と を Ming ら か に し た. さ ら に, プ ロ モ ー タ ー の not activeness に よ っ て mark heritage 伝 son の ノ ッ ク ア ウ ト の phenotype を reappearance で き る こ と を shows し た. Above の よ う に, the in vitro に お い て mark heritage 伝 son の ノ ッ ク ア ウ ト お よ び before turning 発 line is simple を に え る gimmick を establish し た. The <s:1> technology <e:1> utilizes the residual 伝 sub-functions of によ and 々な standards for functional analysis に contribution で る る <s:1> と と examination える. The research results of また, を れら will be presented at a professional academic conference of に, て and て, which will also be held in を and った.