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疾患研究応用に向けたヒトiPS細胞からの高効率B細胞誘導法の開発

开发人类 iPS 细胞的高效 B 细胞诱导方法，用于疾病研究

基本信息

批准号：
26860737
负责人：
平本貴史
金额：
$ 2.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26860737/
关键词：
iPS細胞 B細胞分化誘導遺伝子導入

项目摘要

本年度は以下の3つの研究を行った。①当研究室にて樹立したヒトiPS細胞をMEF細胞上より剥離し、胚様体形成を行った。分化誘導後16-40日目にて胚様体を回収し、CD34陽性細胞を分離してMS-5細胞上に播種し、 B細胞系への分化誘導を行った。MS-5細胞上への播種後4週間目にてB細胞マーカーであるCD19陽性細胞が極めて低効率（CD45陽性細胞中の1%以下）で検出された。この結果は予想した通り、遺伝子導入なしにヒトiPS細胞からB細胞系譜への分化誘導が困難であることを示すと考える。②申請書に示した候補遺伝子のうち、すでにクローニングできている遺伝子について臍帯血由来造血幹細胞に遺伝子導入を行い、リンパ球系細胞の分化能について確認を行った。まずEF1aプロモーターにて候補遺伝子が発現するレンチウイルスベクターを開発し、造血幹細胞に強制発現させたところ、リンパ球系細胞へ分化した細胞は確認できなかった。　次に上記の候補遺伝子をドキシサイクリン濃度依存的に発現させるレンチウイルスベクターを構築した。候補遺伝子の代わりに緑色蛍光タンパク質を発現誘導できるベクターをヒト臍帯静脈内皮細胞に導入してベクターの品質評価試験を行ったところ、ドキシサイクリン濃度依存的にGFPを発現誘導できることが確認された。現在は、臍帯血由来造血細胞やiPS細胞への導入条件の最適化を行っている。③我々は同時に造血幹細胞を含む血球系細胞への複数遺伝子を可能に高効率にする導入するベクターの開発を行った。我々は当研究室で新規開発した麻疹ウイルスベクターを用いて、これら血球系細胞への遺伝子導入を行った。5遺伝子搭載麻疹ウイルスベクターは造血幹・前駆細胞、B細胞系細胞へ8割以上の導入効率を示し、また安定的に5遺伝子の高い発現が確認できた。

This year, the following three research projects were carried out. 1. When iPS cells were established in the laboratory, MEF cells were isolated and embryos were formed. 16-40 days after induction, embryos were recovered, CD34 positive cells were isolated, seeded on MS-5 cells, and B cell line differentiation was induced. The percentage of CD19 positive cells in MS-5 cells was extremely low (<1% of CD45 positive cells) at 4 weeks after seeding. The results showed that it was difficult to induce differentiation of iPS cells and B cell lineages. (2) The application document indicates that the candidate gene can be introduced into the umbilical blood-derived hematopoietic stem cells, and the differentiation ability of the hematopoietic stem cells can be confirmed. EF1a is a candidate for development, hematopoietic stem cell stress development, and hematopoietic stem cell differentiation. Next, the candidate gene is selected from the group consisting of the following components: Candidate gene expression was induced by green fluorescent protein and confirmed by quality evaluation test for introduction of green fluorescent protein into umbilical vein endothelial cells. Now, we need to optimize the introduction conditions for umbilical blood-derived hematopoietic cells and iPS cells. 3. We are also interested in the development of hematopoietic stem cells containing multiple genes that can be introduced at high rates. We have developed a new protocol for the introduction of DNA into human blood cell lines. 5. The efficiency of introduction of hematopoietic stem cells and B-cell lines into 5-cell lines and stable 5-cell lines was confirmed.