腎集合管主細胞におけるH^+感受性レセプターのクローニング

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生体はpHに反応し、細胞単位で様々な代謝の変化が誘導される。腎集合管は最終尿pHを規定する分節として重要である。最近、我々はアルカリにより転写亢進する腎集合管のタンパクについて報告した。この転写亢進はチロシンキナーゼ阻害薬により消失することから、腎集合管主細胞には、チロシンキナーゼドメインを内在するH^+感受性レセプターが存在すると考え、クローニングを試みた。以下に現在までの研究概要を記す。1.細胞培養:SV40で形質転換した3-6世代の兎腎集合管主細胞の培養細胞を用いた。2.mRNA抽出、RT-PCR:チロシンキナーゼドメインの保存領域に村応するdegenerative primerを作成し、得られたpoly(A)^+mRNAからRT-PCRを行った。期待される約200bpのPCR productをPCRTMII vector(Invitrogen)に導入し、ジデオキシ法により塩基配列を決定した。3.得られたprotein kinase domainを有する2クローンについて、RACE法によりfull-length cDNAを得た。1264アミノ酸からなる6回膜貫通型タンパクであった。4.Xenopus oocyteに上記クローンのcRNAをtransfectionし、細胞外pH依存性のprotein kinase activityの変化を確認中だが、現在までpH依存性は認められていない。