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Studies on the production and cell surface expression of short-chain glycosylated proteins by lysosomal exocytosis

溶酶体胞吐作用产生短链糖基化蛋白及其细胞表面表达的研究

基本信息

批准号：
21K21346
负责人：
藤田盛久
金额：
$ 36.86万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Fund for the Promotion of Joint International Research (Home-Returning Researcher Development Research)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-02-18 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、哺乳動物細胞において、マンノースが３残基以下からなるN結合型糖鎖（パウチマンノース糖鎖）がどのように形成され、細胞表面へ露出されるのかを明らかにすることを目的としている。まず、HEK293、THP1、HuH7細胞からパウチマンノースを有する糖ペプチドをグライコプロテオミクス解析で同定したところ、60％以上がリソソーム由来のタンパク質であった。HuH7細胞を用いて、リソソーム局在糖加水分解酵素であるHEXAやMAN2B1の遺伝子を欠損した細胞を作出した結果、これらの細胞では、リソソーム酵素上のパウチマンノース含有量が減少した。つぎに、パウチマンノースを認識する抗体であるMannitouを用いて、細胞表面のパウチマンノースを染色した。その結果、エンドサイトーシスの阻害剤、mTORの阻害剤、カルシウム・イオノフォアでMannitouによる細胞表面染色が増加した。一方で、リソソーム・エキソサイトーシスの阻害剤であるVacuolin-1ではMannitou染色が低下した。このことから、パウチマンノース糖鎖は、リソソームで形成され、カルシウム依存的なリソソーム・エキソサイトーシスを介して細胞表面に露出していることが示唆された。さらに、リソソームの代表的なタンパク質であるLAMP1の細胞表面発現が低下する変異細胞を遺伝学的スクリーニングにより濃縮し、その責任遺伝子候補を同定した。この候補遺伝子をHuH7でノックアウトすると、LAMP1の表面発現が半分程度に減少し、リソソーム酵素の培地中への分泌も低下したことから、リソソーム・エキソサイトーシスに部分的に欠損を生じていることが示唆された。ノックアウト細胞では、Mannitouによる細胞表面染色も低下した。現在、この遺伝子について解析を進めている。

In this study, the cells of mammals, mamm The cells of HEK293, HEK293, THP1, HuH7, and so on, there are many kinds of sugar, such as sugar, sugar, sugar and sugar. The results of HuH7 cell culture were obtained by adding sugar and water to decompose the enzyme, HEXA, MAN2B1, and so on. The results showed that the enzyme content was low. The antibody was detected by Mannitou, and the cell surface was stained by staining. The results showed that the cell surface staining was enhanced by cell surface staining. The results showed that mTOR was blocked, mTOR was blocked, and cell surface staining was detected. One side, the other, the Vacuolin-1, the Mannitou staining, the low staining. The cell surface is exposed in the form of sugar, sugar The cell surface is low. The cell surface is low. There is a slight increase in the degree of low secretion of enzymes on the surface of HuH7 and LAMP1. The secretion of enzymes in the culture ground is low. The cells were stained with low staining on the surface of the cells and Mannitou cells were stained. At present, we are in the process of analyzing and analyzing the situation.