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Studies on the production and cell surface expression of short-chain glycosylated proteins by lysosomal exocytosis

溶酶体胞吐作用产生短链糖基化蛋白及其细胞表面表达的研究

基本信息

批准号：
21K21346
负责人：
藤田盛久
金额：
$ 36.86万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Fund for the Promotion of Joint International Research (Home-Returning Researcher Development Research)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-02-18 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、哺乳動物細胞において、マンノースが３残基以下からなるN結合型糖鎖（パウチマンノース糖鎖）がどのように形成され、細胞表面へ露出されるのかを明らかにすることを目的としている。まず、HEK293、THP1、HuH7細胞からパウチマンノースを有する糖ペプチドをグライコプロテオミクス解析で同定したところ、60％以上がリソソーム由来のタンパク質であった。HuH7細胞を用いて、リソソーム局在糖加水分解酵素であるHEXAやMAN2B1の遺伝子を欠損した細胞を作出した結果、これらの細胞では、リソソーム酵素上のパウチマンノース含有量が減少した。つぎに、パウチマンノースを認識する抗体であるMannitouを用いて、細胞表面のパウチマンノースを染色した。その結果、エンドサイトーシスの阻害剤、mTORの阻害剤、カルシウム・イオノフォアでMannitouによる細胞表面染色が増加した。一方で、リソソーム・エキソサイトーシスの阻害剤であるVacuolin-1ではMannitou染色が低下した。このことから、パウチマンノース糖鎖は、リソソームで形成され、カルシウム依存的なリソソーム・エキソサイトーシスを介して細胞表面に露出していることが示唆された。さらに、リソソームの代表的なタンパク質であるLAMP1の細胞表面発現が低下する変異細胞を遺伝学的スクリーニングにより濃縮し、その責任遺伝子候補を同定した。この候補遺伝子をHuH7でノックアウトすると、LAMP1の表面発現が半分程度に減少し、リソソーム酵素の培地中への分泌も低下したことから、リソソーム・エキソサイトーシスに部分的に欠損を生じていることが示唆された。ノックアウト細胞では、Mannitouによる細胞表面染色も低下した。現在、この遺伝子について解析を進めている。

In this study, mammalian cells were exposed to N-binding glycoconjugates at residues 3 and below, and cell surface was exposed to N-binding glycoconjugates. For example, HEK293, THP1 and HuH7 cells can be used to analyze the quality of the products. HuH7 cells were found to be deficient in the presence of HEXA and MAN 2B1, and the presence of HEXA and MAN 2B1 in the presence of HEXA decreased. The cell surface is stained with antibodies. The results showed that the cell surface staining increased due to the presence of inhibitors, mTOR inhibitors, and Mannitou inhibitors. One side, the solution, the solution, the resistance, the Vacuolin-1 solution, the Mannitou solution, the resistance, the Mannitou solution, the Mannitou solution. The cell surface is exposed to light and light. The cell surface of LAMP1 was found to be low, and the cell surface of LAMP 1 was found to be low. The candidate gene HuH7 was found to have a half-degree of surface expression, and the secretion of the enzyme in the culture was reduced to a half-degree. The cell surface staining was low. Now, this is the first time I've ever been to a school.