部位特異的化学修飾による膜蛋白質高次構造の決定

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本研究では、テトラサイクリン排出蛋白Tet(B)を素材として、蛋白工学的手法により立体構造の推定を行った。まず、Cys-free変異体をもとに、任意の位置の残基をCysに置換した変異体を多数構築し、膜透過性のSH試薬NEMと、膜不透過性のAMSを用いて、生菌体で両者ともに結合するものは菌体表層(ペリプラズム側)、NEMのみ結合するものは菌体の内側という基準で、膜を12回貫通する蛋白であることを、初めて活性のある膜蛋白を用いて実験的に決定することに成功した。この方法は異物排出蛋白のみならず、膜貫通蛋白の構造決定に広く応用できる普遍的な方法である。ついで、連続的にCys置換した一連のCys走査変異体を用いて、疎水的な領域ではNEMとの反応生が悪く、親水的な領域では良いという原理に基づいて、膜貫通領域の範囲を精密に決定した。さらに、これまで立体構造が決定された膜タンパク質の、膜貫通セグメントの配置に法則性のあることを見いだし、その法則に基づいてTetA(B)の膜貫通セグメントを配置し、量子力学的エネルギー計算によって構造を最適化するという手法により、膜輸送蛋白としては初めて、立体構造モデルを構築することに成功した。