繊毛が成体脳の神経新生と神経細胞の機能に果たす役割の解析

纤毛在成人脑神经发生和神经元功能中的作用分析

基本信息

批准号：
13J02368
负责人：
茶屋太郎
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University (2014)Kyoto University (2013)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J02368/
关键词：
繊毛蛋白質輸送神経キナーゼ

项目摘要

本年度は新規に繊毛へ局在するキナーゼを同定するために、培養細胞を用いたキナーゼの細胞内局在スクリーニングを行った。これはFlagタグを付加した目的の蛋白質をNIH3T3細胞に発現させ、Flagと繊毛のマーカーであるアセチル化チューブリンに対する抗体を用いた免疫染色により繊毛への局在の有無を判定するものである。現在までに2つの繊毛において機能未知のキナーゼが繊毛に局在することを見出した。これらはいずれもICKとキナーゼドメインにおける相同性が高く、ICKと同様の機能を持つ可能性があり興味が持たれる。今後は、培養細胞を用いた実験により繊毛形成や繊毛内輸送に対する機能を調べ、さらにノックアウトマウスの作製を行いその表現型を解析し、生体内における機能を明らかにしたい。また昨年度まで私たちが行ってきたICKの機能解析をさらに発展させる形で内耳有毛細胞におけるICKの機能を解析することにより、繊毛の形成・機能異常に起因する聴覚障害が引き起こされる分子メカニズムを明らかにすることを目的として研究を行った。私たちはICK欠損マウスにおいて、蝸牛の長さが短縮していることを見出した。有毛細胞を走査型電子顕微鏡を用いて観察すると、ICK欠損マウスにおいて、V字型に配列した不動毛の頂点に動毛が存在しないものや、不動毛の配置の規則性が乱れているものが増加していた。次にICKの欠損による聴力への影響を調べた。ICK欠損マウスは新生児致死となり成体マウスでの解析ができないため、ICK floxマウスと内耳においてCreを発現するトランスジェニックマウスを掛け合わせて、コンディショナルノックアウト（CKO）マウスを得た。このICKを内耳において欠損させたマウスを用いて、聴性脳幹反応（ABR）や歪成分耳音響放射（DPOAE）を測定すると、ICK CKOマウスでは聴力の低下が認められた。

在今年，为了鉴定新局部的激酶，我们使用培养细胞进行了激酶的细胞内定位筛选。这是一种表达在NIH3T3细胞中添加标志标签的靶蛋白的方法，并确定它是否通过使用针对FLAG和乙酰化管蛋白的抗体进行免疫染色（CILIA的标志物）来定位于纤毛。迄今为止，我们发现未知的功能激酶位于两个纤毛中的纤毛中。所有这些都具有ICK的激酶域中具有高的同源性，并且很感兴趣，因为它们的功能可能与ICK相似。将来，我们希望通过使用培养细胞进行实验来研究纤毛形成和核内转运的功能，并进一步开发基因敲除小鼠以分析其表型，并阐明它们在体内的功能。此外，通过进一步开发直到去年进行的ICK的功能分析，我们分析了ICK在内耳毛细胞中的功能，并阐明了导致纤毛形成和功能异常引起的听力障碍的分子机制。我们发现在缺陷的小鼠中，耳蜗长度降低了。当使用扫描电子显微镜观察毛细胞时，在缺乏ICK的小鼠中，在固定的头发的顶端不存在毛发的毛发数量增加，而固定的头发的顶端则有V形状，并且固定的头发的规律性受到干扰。接下来，检查了ICK缺乏对听力的影响。由于缺乏ICK的小鼠是新生儿致死的，无法在成年小鼠中分析，因此通过将ICK Flox小鼠和表达CRE的转基因小鼠繁殖而获得有条件的敲除（CKO）小鼠。当测量内耳中这种ICK缺陷的小鼠时，当听觉脑干反应（ABR）和扭曲的耳声辐射（DPOAE）时，在ICK CKO小鼠中观察到听力丧失。