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ヘプシジン関連創薬のためのＥＰＩＣシステムを応用した活性型ヘプシジン測定系の開発

使用 EPIC 系统开发活性铁调素测量系统，用于铁调素相关药物发现

基本信息

批准号：
26461394
负责人：
佐々木勝則
金额：
$ 3.16万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ヘプシジン（Hpc）は細胞膜表面のフェロポルチン（Fpn）に作用し小腸や網内系細胞からの鉄の供給を負に制御する。Hpc産生低下は鉄過剰状態を引き起こし、一方、Hpc過剰産生は鉄欠乏状態を招く。このようなHpcに起因する病態に対する治療戦略として、Hpc agonists/antagonistsの開発が注目されている。そこで、Hpc活性測定システムとして、Fpn-GFPを安定発現した細胞株を用いたcell-based bioassayを構築し、その有効性の検証を目的とした。はじめに、クローニングしたFpn-GFP発現細胞株[A-3]のHpc isoforms; hep-20、hep-22、hep-25に対する反応性を、Flow cytometry法で評価した。結果、hpc-25を添加、培養したアッセイ系のみがhpc-25濃度依存的に蛍光減弱を示した。すなわち、今回樹立したFpn-GFP発現細胞株がcell-based bioassayとして利用可能な細胞であることを確認することができた。次に、High-throughput screeningシステムとして、細胞を刺激すると、細胞内シグナル伝達に伴う細胞骨格の変化や細胞内分子のトランスロケーションが引き起こされる動的な質量の再分布；Dynamic mass redistribution（DMR）を捉えることを可能としたEpicシステムの適応性を検討した。予め96ウェル・ラベルフリー測定用マイクロプレートに播種したA-3細胞株にHpc isoformsをそれぞれ添加し、リアルタイムでDMRをモニタリングしたところ、hpc-25を添加した系のみが動的な質量の再分布・変化を示した。このように、試料中のhpc-25濃度を生物活性として直接定量することが可能なシステムを構築することができた。

HPC (Hpc) acts on the surface of the cell membrane and controls the function of endothelial cells in the small intestine. If the HPC is low, it will lead to a state of deficient HPC.このようなHpcにcausesするpathologyに対するtreatment戦strategyとして、Hpc agonists/antagonistsの开発がAttentionされている.そこで, Hpc activity assay システムとして, Fpn-GFP stable and stable cell line した cell line を constructed using いたcell-based bioassay, そのeffectiveness の検证をpurpose とした. Hpc isoforms of はじめに、クローニングしたFpn-GFP present cell line [A-3]; Cytometry method is not evaluated. As a result, the HPC-25 concentration-dependent HPC-25 concentration-dependent HPC-25 concentration-dependent HPC-25 concentration-dependent HPC-25 concentration-dependent HPC-25 concentration-dependent HPC-25 concentration-dependent growth was found. We have now established a cell-based bioassay for the Fpn-GFP cell line and confirmed that it is possible to use it. Second, High-throughput screening システムとして, cell をstimulation すると, intracellular シグナル伝达に合うcytoskeleton のDynamic redistribution of the mass of intracellular molecules in the cell; Dynamic mass redistribution (DMR)をCATCH えることをpossibleとしたEpicシステムのAdaptabilityを検した. Determination of Hpc of the A-3 cell line seeded with 96 ウウェル・ラベルフリー using the マイイクロプレートにisoformsをそれぞれaddし、リアルタイムでDMRをモニタリングしたところ、hpc-25をAdd the した system のみがなmass redistribution and change をshow した. The concentration of HPC-25 in the sample and the biological activity can be directly quantified.