ヘプシジン関連創薬のためのＥＰＩＣシステムを応用した活性型ヘプシジン測定系の開発

ヘプシジン（Hpc）は細胞膜表面のフェロポルチン（Fpn）に作用し小腸や網内系細胞からの鉄の供給を負に制御する。Hpc産生低下は鉄過剰状態を引き起こし、一方、Hpc過剰産生は鉄欠乏状態を招く。このようなHpcに起因する病態に対する治療戦略として、Hpc agonists/antagonistsの開発が注目されている。そこで、Hpc活性測定システムとして、Fpn-GFPを安定発現した細胞株を用いたcell-based bioassayを構築し、その有効性の検証を目的とした。はじめに、クローニングしたFpn-GFP発現細胞株[A-3]のHpc isoforms; hep-20、hep-22、hep-25に対する反応性を、Flow cytometry法で評価した。結果、hpc-25を添加、培養したアッセイ系のみがhpc-25濃度依存的に蛍光減弱を示した。すなわち、今回樹立したFpn-GFP発現細胞株がcell-based bioassayとして利用可能な細胞であることを確認することができた。次に、High-throughput screeningシステムとして、細胞を刺激すると、細胞内シグナル伝達に伴う細胞骨格の変化や細胞内分子のトランスロケーションが引き起こされる動的な質量の再分布；Dynamic mass redistribution（DMR）を捉えることを可能としたEpicシステムの適応性を検討した。予め96ウェル・ラベルフリー測定用マイクロプレートに播種したA-3細胞株にHpc isoformsをそれぞれ添加し、リアルタイムでDMRをモニタリングしたところ、hpc-25を添加した系のみが動的な質量の再分布・変化を示した。このように、試料中のhpc-25濃度を生物活性として直接定量することが可能なシステムを構築することができた。

ヘプシジン（Hpc）は細胞膜表面のフェロポルチン（Fpn）に作用し小腸や網内系細胞からの鉄の供給を負に制御する。Hpc産生低下は鉄過剰状態を引き起こし、一方、Hpc過剰産生は鉄欠乏状態を招く。このようなHpcに起因する病態に対する治療戦略として、Hpc agonists/antagonistsの開発が注目されている。そこで、Hpc活性測定システムとして、Fpn-GFPを安定発現した細胞株を用いたcell-based bioassayを構築し、その有効性の検証を目的とした。はじめに、クローニングしたFpn-GFP発現細胞株[A-3]のHpc isoforms; hep-20、hep-22、hep-25に対する反応性を、Flow cytometry法で評価した。結果、hpc-25を添加、培養したアッセイ系のみがhpc-25濃度依存的に蛍光減弱を示した。すなわち、今回樹立したFpn-GFP発現細胞株がcell-based bioassayとして利用可能な細胞であることを確認することができた。次に、High-throughput screeningシステムとして、細胞を刺激すると、細胞内シグナル伝達に伴う細胞骨格の変化や細胞内分子のトランスロケーションが引き起こされる動的な質量の再分布；Dynamic mass redistribution（DMR）を捉えることを可能としたEpicシステムの適応性を検討した。予め96ウェル・ラベルフリー測定用マイクロプレートに播種したA-3細胞株にHpc isoformsをそれぞれ添加し、リアルタイムでDMRをモニタリングしたところ、hpc-25を添加した系のみが動的な質量の再分布・変化を示した。このように、試料中のhpc-25濃度を生物活性として直接定量することが可能なシステムを構築することができた。