TRAIL耐性分子メカニズムの解析と臨床応用

アポトーシス誘導作用を示すTRAILは、がん治療への応用が期待される。一方でTRAIL受容体を発現しながらもTRAIL耐性を示すがん細胞の存在も報告されており、アポトーシス耐性獲得の機序を解析することは、TRAIL耐性を克服する有効ながんの治療法開発へと結びつくものである。本研究では、リボザイム・ライブラリーを用いたスクリーニングによりTRAILシグナル伝達において「関所」となる候補遺伝子を同定し、これら蛋白質の分子機能を解析し、TRAILの細胞内シグナルにおいてどのような位置付けにあるのかを解析する。ハンマーヘッド型リボザイム・ライブラリーの高発現系として、エピゾーマルに増幅可能なEpstein Barr Virus遺伝子の一部を含む哺乳類動物発現ベクターを作製した。大腸がん細胞株DLD-1にリボザイム・ライブラリーを発現させた後TRAIL刺激を行い耐性獲得細胞を作製した。この細胞内のリボザイム発現ベクターをHart法にて回収し750種のリボザイムを解析した。その結果、TRAIL耐性細胞として、細胞核に存在するステロイド・レセプターRXRβ蛋白やcytoskeletal関連蛋白、DAP Kinase 1蛋白が欠失したフェノタイプ細胞の存在が確認された。さらに2種類の異なるリボザイムが同一のmRNAを標的としたなかに機能未知遺伝子19種類を同定した。Calreticulinに結合しC末端にKinase domainを持つ45kDaの蛋白質、30kDaのPAP2類似リン酸化蛋白質、類似蛋白質が存在せず分類できない蛋白質(25kDa)の3種類のcDNAをそれぞれ過剰発現させることでアポトーシスを誘導することができ、これら蛋白質がTRAIL誘導アポトーシスに関与している可能性が示唆された。

アポトーシス誘導作用を示すTRAILは、がん治療への応用が期待される。一方でTRAIL受容体を発現しながらもTRAIL耐性を示すがん細胞の存在も報告されており、アポトーシス耐性獲得の機序を解析することは、TRAIL耐性を克服する有効ながんの治療法開発へと結びつくものである。本研究では、リボザイム・ライブラリーを用いたスクリーニングによりTRAILシグナル伝達において「関所」となる候補遺伝子を同定し、これら蛋白質の分子機能を解析し、TRAILの細胞内シグナルにおいてどのような位置付けにあるのかを解析する。ハンマーヘッド型リボザイム・ライブラリーの高発現系として、エピゾーマルに増幅可能なEpstein Barr Virus遺伝子の一部を含む哺乳類動物発現ベクターを作製した。大腸がん細胞株DLD-1にリボザイム・ライブラリーを発現させた後TRAIL刺激を行い耐性獲得細胞を作製した。この細胞内のリボザイム発現ベクターをHart法にて回収し750種のリボザイムを解析した。その結果、TRAIL耐性細胞として、細胞核に存在するステロイド・レセプターRXRβ蛋白やcytoskeletal関連蛋白、DAP Kinase 1蛋白が欠失したフェノタイプ細胞の存在が確認された。さらに2種類の異なるリボザイムが同一のmRNAを標的としたなかに機能未知遺伝子19種類を同定した。Calreticulinに結合しC末端にKinase domainを持つ45kDaの蛋白質、30kDaのPAP2類似リン酸化蛋白質、類似蛋白質が存在せず分類できない蛋白質(25kDa)の3種類のcDNAをそれぞれ過剰発現させることでアポトーシスを誘導することができ、これら蛋白質がTRAIL誘導アポトーシスに関与している可能性が示唆された。