TRAIL耐性分子メカニズムの解析と臨床応用

TRAIL耐药的分子机制分析及临床应用

基本信息

批准号：
15025264
负责人：
佐々木勝則
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Sapporo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アポトーシス誘導作用を示すTRAILは、がん治療への応用が期待される。一方でTRAIL受容体を発現しながらもTRAIL耐性を示すがん細胞の存在も報告されており、アポトーシス耐性獲得の機序を解析することは、TRAIL耐性を克服する有効ながんの治療法開発へと結びつくものである。本研究では、リボザイム・ライブラリーを用いたスクリーニングによりTRAILシグナル伝達において「関所」となる候補遺伝子を同定し、これら蛋白質の分子機能を解析し、TRAILの細胞内シグナルにおいてどのような位置付けにあるのかを解析する。ハンマーヘッド型リボザイム・ライブラリーの高発現系として、エピゾーマルに増幅可能なEpstein Barr Virus遺伝子の一部を含む哺乳類動物発現ベクターを作製した。大腸がん細胞株DLD-1にリボザイム・ライブラリーを発現させた後TRAIL刺激を行い耐性獲得細胞を作製した。この細胞内のリボザイム発現ベクターをHart法にて回収し750種のリボザイムを解析した。その結果、TRAIL耐性細胞として、細胞核に存在するステロイド・レセプターRXRβ蛋白やcytoskeletal関連蛋白、DAP Kinase 1蛋白が欠失したフェノタイプ細胞の存在が確認された。さらに2種類の異なるリボザイムが同一のmRNAを標的としたなかに機能未知遺伝子19種類を同定した。Calreticulinに結合しC末端にKinase domainを持つ45kDaの蛋白質、30kDaのPAP2類似リン酸化蛋白質、類似蛋白質が存在せず分類できない蛋白質(25kDa)の3種類のcDNAをそれぞれ過剰発現させることでアポトーシスを誘導することができ、これら蛋白質がTRAIL誘導アポトーシスに関与している可能性が示唆された。

表现出诱导凋亡作用的TRAIL预计将应用于癌症治疗。另一方面，还报道了表达远程受体阻力的癌细胞的存在，并且分析抑制凋亡的机制将导致发展有效的癌症治疗，从而克服了阻力。在这项研究中，通过使用核酶库进行筛选，分析这些蛋白质的分子功能，并分析它们在TRAIL的细胞内信号中的位置，从而鉴定出是跟踪信号传导中“靶标”的候选基因。哺乳动物的动物表达载体，其中包含一部分偶发放大的爱泼斯坦Barr病毒基因作为Hammerhead型核酶库的高表达系统。核酶文库在结肠癌细胞系DLD-1中表达，并刺激TRAIL产生抗性细胞。通过HART方法收集该细胞中的核酶表达载体，并分析了750个核酶。结果，已经证实，已从类固醇受体RXRβ蛋白，细胞骨架相关蛋白和DAP激酶1蛋白中发现的表型细胞的存在是在细胞核中发现的抗越野细胞。此外，在针对相同mRNA的两个不同的核酶中鉴定了19种未知功能基因。可以通过过度表达三种类型的cDNA来诱导凋亡：一种与钙网蛋白结合的45 kDa蛋白，并在C-末端具有一个激酶结构域，一种30 kDa Pap2样磷酸化的蛋白质，一种不存在并且不能分类的蛋白质（25 kDa），该蛋白可能与这些蛋白质进行了分类（25 kDa），这可能涉及蛋白质。