植物におけるエピジェネティクス関連酵素のスクリーニング法の確立

染色体を構成するDNA-ヒストンタンパク質複合体：ヌクレオソーム及びクロマチンを試験管内で再構築する当研究室独自の手法を、新たにモデル植物であるシロイヌナズナについて適用すること、さらに再構築ヌクレオソーム・クロマチンを基質として利用し、ヒトや酵母に比べて生化学的知見の少ない植物のエピジェネティクスに関連するヒストン修飾酵素の機能解明を目的に研究を実施した。試験管内ヌクレオソーム・クロマチン再構築法については、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法をベースにDNA存在下でシロイヌナズナヒストンH2A、H2B、H3、H4をコードするmRNAを共翻訳することで、ヌクレオソーム及びクロマチンの形成が確認された。環状DNA、ヌクレオソームポジショニング配列を含む直鎖DNAなど長さや塩基配列、形状の異なるDNAに対してヌクレオソームが形成されることを確認した。さらにH2AXやH3.3など5種のヒストンバリアントを含むヌクレオソーム再構築反応を実施したところ、数種類について本手法による再構築能が認められ、今後論文投稿を予定している。ヌクレオソームの高純度精製法を模索した結果、マグネシウム沈殿とスクロース密度勾配遠心分離を組み合わせることで本ヌクレオソーム再構築法に対する精製法を確立した。精製ヌクレオソームに対し、蛍光色素を用いた熱安定性の測定を実施したところ既存の報告とのおおよその一致が確認された。ヒストン修飾酵素の生化学的機能解析については、シロイヌナズナに先立ち当研究室で既に再構築反応が確立したヒトヌクレオソームを基質に実施した。ヒストン修飾反応後、Arg-Cによるゲル内消化を経てプロテオミクス解析を行なったが、目的のヒストンN末端領域のペプチド検出が認められなかったため、Arg-C消化等について条件検討が必要である。以上の研究成果をもとに分子生物学会年会にてポスター発表を実施した。

染色体を構成するDNA-ヒストンタンパク質複合体：ヌクレオソーム及びクロマチンを試験管内で再構築する当研究室独自の手法を、新たにモデル植物であるシロイヌナズナについて適用すること、さらに再構築ヌクレオソーム・クロマチンを基質として利用し、ヒトや酵母に比べて生化学的知見の少ない植物のエピジェネティクスに関連するヒストン修飾酵素の機能解明を目的に研究を実施した。試験管内ヌクレオソーム・クロマチン再構築法については、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法をベースにDNA存在下でシロイヌナズナヒストンH2A、H2B、H3、H4をコードするmRNAを共翻訳することで、ヌクレオソーム及びクロマチンの形成が確認された。環状DNA、ヌクレオソームポジショニング配列を含む直鎖DNAなど長さや塩基配列、形状の異なるDNAに対してヌクレオソームが形成されることを確認した。さらにH2AXやH3.3など5種のヒストンバリアントを含むヌクレオソーム再構築反応を実施したところ、数種類について本手法による再構築能が認められ、今後論文投稿を予定している。ヌクレオソームの高純度精製法を模索した結果、マグネシウム沈殿とスクロース密度勾配遠心分離を組み合わせることで本ヌクレオソーム再構築法に対する精製法を確立した。精製ヌクレオソームに対し、蛍光色素を用いた熱安定性の測定を実施したところ既存の報告とのおおよその一致が確認された。ヒストン修飾酵素の生化学的機能解析については、シロイヌナズナに先立ち当研究室で既に再構築反応が確立したヒトヌクレオソームを基質に実施した。ヒストン修飾反応後、Arg-Cによるゲル内消化を経てプロテオミクス解析を行なったが、目的のヒストンN末端領域のペプチド検出が認められなかったため、Arg-C消化等について条件検討が必要である。以上の研究成果をもとに分子生物学会年会にてポスター発表を実施した。