細胞の成長制御を司るmTOR経路のカルシウムシグナルによる新規調節機構の解明

阐明控制细胞生长的 mTOR 途径钙信号的新型调节机制

基本信息

批准号：
22KJ1595
负责人：
雨宮優奈
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1595/
关键词：
mTORC1 Calcium Calmodulin TSC2

项目摘要

報告者らは、これまでに動物細胞へのアミノ酸投与が細胞内Ca2+濃度の上昇を引き起こし、mTORC1活性を正に制御することを見出してきている。さらに、Ca2+シグナルをmTORC1経路へと伝達する因子として、Ca2+結合タンパク質であるcalmodulin（CaM）を見出し、mTORC1経路の強い負の制御因子であるTSC2（tuberous sclerosis complex 2）とCaMがCa2+依存的に結合すること、またその結合領域を報告してきた。そこで、CaMがTSC2を介してmTORC1の活性を制御するその詳しい分子機構の解明を通じ、mTORC1の異常活性を伴う種々の病態発症の分子基盤の解明や、治療法の開発に貢献することを目指している。報告者らはこれまでにTSC2のCaM結合領域が、mTORC1活性化因子Rhebとの結合に重要であると報告のある領域と重なることを同定している。そのため、令和4年度はCaMがTSC2-Rheb間の結合へ与える影響を明確に評価する方法を探索し、検証した。TSC2-Rheb間の結合に関して、通常広く用いられている免疫沈降法等では、結合を捉えることができなかったため、深海エビ由来発光酵素ルシフェラーゼの小断片（HiBiT）と大断片（LgBiT）の再会合を利用することで、簡便かつ定量的に結合を評価する方法を用いたところTSC2-Rheb間の結合を捉えることに成功した。また、大腸菌を用いて野生型CaM及びCa2+結合能欠失CaM変異体を添加し、TSC2-Rheb間の結合に変化があるか検証したところ、TSC2-Rheb間の結合は野生型CaMの添加により有意に低下し、Ca2+結合能欠失CaM変異体の添加では変化しなかった。このことから、CaMはTSC2-Rheb間の結合を変化させることでmTORC1活性を制御していると考えられる。

记者先前发现，对动物细胞的氨基酸给药会导致细胞内Ca2+浓度的增加，并积极调节MTORC1活性。此外，我们发现了Ca2+结合蛋白Calmolin（CAM）是将Ca2+信号传输到MTORC1途径的因素，并报告了CAM以Ca2+依赖性方式及其结合区域结合。因此，通过阐明CAM通过TSC2调节MTORC1活性的详细分子机制，我们旨在阐明分子基础，以发作与MTORC1异常活性相关的各种病理学，并为治疗方法的发展做出贡献。记者先前已经确定，TSC2的CAM结合区域与据报道与MTORC1激活剂RHEB结合至关重要的区域重叠。因此，在2022年，我们探索并验证了一种清楚评估CAM对TSC2和RHEB之间联系的方法。关于TSC2-RHEB之间的结合，常用的免疫沉淀方法无法捕获结合，因此，通过使用深海虾的发光酶荧光素酶的小碎片（Hibit）和大片段（LGBIT）的重新结合，我们成功地捕获了TSC2-RHEB之间的结合方法。此外，当使用大肠杆菌添加缺乏Ca2+结合的野生型CAM和CAM突变体时，我们验证了TSC2-RHEB之间的结合是否发生了变化，并发现TSC2-RHEB之间的结合显着降低，而添加了野生型CAM，并且与Ca2+结合能力的添加并非添加。由此，可以认为CAM通过改变TSC2和RHEB之间的结合来调节MTORC1活性。