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RANKL刺激で出現する核内構造体におけるRNA制御を介した骨代謝制御機構の解明

阐明 RANKL 刺激后出现的核结构中 RNA 调节介导的骨代谢控制机制

基本信息

批准号：
22KJ2800
负责人：
荒崎恭弘
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Cpeb4はCPE配列を含むmRNAに結合する因子であり，転写後調節を介して，がん系統分化や赤血球終末分化を制御する。以前，私は，Cpeb4が破骨細胞分化を促進する因子であることを報告したが，Cpeb4の詳細な分化メカニズムや標的遺伝子は不明であった。そこで，Cpeb4抑制時に遺伝子発現が減少した，破骨細胞マスター転写因子であるNfatc1に着目し，Cpeb4による転写後調節を検討した。shRNAによりCpeb4を抑制したRAW264.7株を用いて，RNA-seq解析およびqPCRを行った結果，未分化状態にも関わらず，破骨細胞分化遺伝子が有意に減少した。またRANKL刺激によるRANKL下流シグナル（p-Akt, p-IkB, p-JNK, p-p38）の活性が減少した。さらに，細胞増殖が促進していることが明らかになった。Nfatc1 mRNAおよびタンパク質量は，Cpeb4抑制により減少した。次に，Cpeb4がNfatc1の転写後調節を制御するかを検討した。転写阻害剤DRB処理後に残存するNfatc1 mRNA量をqPCRで検討したところ，Cpeb4抑制により安定性が減少した。しかしながら，Nfatc1の3’UTRをクローニングし，luciferase assayを行った結果，有意な差は見られなかった。そこで，Nfatc1の転写に着目し，Nfatc1の2種類のプロモーターP1およびP2の活性を検討するために，luciferase assayを行った。その結果，Cpeb4抑制により，P1活性が減少した。また，Cpeb4抑制によってP1領域におけるH3K4me3化の減少，H3K27me3化の増加が見られ，Nftac1転写が強力に抑制された。以上から，Cpeb4はNfatc1 mRNAの安定性を増加し，また転写を間接的に促進することで破骨細胞分化を促進することが示唆された。

Cpeb4 gene sequence contains mRNA binding factors that mediate post-transcription regulation and control of systemic differentiation and erythroid terminal differentiation. In the past, Cpeb4 has been reported as a factor promoting osteoclast differentiation, and Cpeb4 has been reported as a factor promoting osteoclast differentiation. When Cpeb4 is inhibited, gene expression is reduced, and osteoclast gene expression is reduced. When Cpeb4 is inhibited, gene expression is regulated. shRNA Cpeb4 was inhibited by RAW264.7 strain, RNA-seq analysis and qPCR were performed. The results showed that the undifferentiated state was not detected, and the osteoclast differentiation gene was intentionally reduced. RANKL down-regulation (p-Akt, p-IkB, p-JNK, p-p38) activity was reduced by RANKL stimulation. The cell proliferation is promoted by the sun. Nfatc1 mRNA is inhibited by Cpeb4. Next, Cpeb4 and Nfatc1 are discussed for post-write regulation. The amount of Nfatc1 mRNA remaining after DRB treatment was detected by qPCR, and the stability of Cpeb4 inhibition was reduced. Nfatc1's 3'UTR is the result of the luciferase assay, which is intended to be different. In addition, the activity of Nfatc1 and P2 was investigated. As a result, Cpeb4 was inhibited and P1 activity decreased. In addition, Cpeb4 inhibition was strongly inhibited by the decrease of H3K4me3 in the P1 domain, the increase of H3K27me3 in the Nftac domain, and the decrease of H3K4me3 in the Nftac domain. As described above, Cpeb4 increases the stability of Nfatc1 mRNA and indirectly promotes osteoclast differentiation.