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膜タンパク質Na⌒,K⌒-ATPaseの機能と共役したサブユニット構造の変化

亚基结构的变化与膜蛋白 Na⌒,K⌒-ATPase 的功能耦合

基本信息

批准号：
61580150
负责人：
林雄太郎
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyorin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.可溶化【Na^+】,【K^+】-ATPaseの酵素活性を、高性能ゲルクロマトグラフィー・カラムの中で発現させる条件が、以下のように決まった。(1)カラム:TSKgel G3000SW(7.5×600mm)(2)溶出緩衝液:0.3mg/ml 【C_(12)】【E_8】,60μg/mlフォスファチジルセリン(牛脳,98%純度.Sigma社)、0.05MNaCl,0.05MKCl,1.33mMATP,4mMMg【Cl_2】,1mMEDTA,10mMイミダゾール-15mMHEPES,ph7.0(3)その他:流速0.50ml/分;温度,20℃。以上の条件で、8.6から281μg蛋白質の可溶化ATPaseをカラムに負荷して、クロマトグラフィーを行った。その結果、蛋白質負荷量に依らず、常に単一の蛋白質成分が溶出した。溶出液中のPiを測定することにより、カラム通過時のATPase比活性が測定された。それはまた、蛋白質量に依存せずほぼ一定で、1.94±0.13μmolPi/min/mg proteinであった。この活性値は、膜結合型【Na^+】,【K^+】-ATPaseの比活性の64±4%で、insituの活性値にほぼ匹敵するものであった。2.上記のクロマトグラフィーで溶出した蛋白質成分の分子量を低角レーザー光散乱法で測定した。その結果、分子量は最大値214,000から,蛋白質量の減少に応じて、小さくなった。34.2μg以下の蛋白質量では、αβ-プロトマーに相当した分子量(160,000±3,000)で一定であった。以上の結果より、ATPase活性を発現できる最小構造単位は、【(αβ)_2】-ダイプロトマーではなく、αβ-プロトマーであると結論した。3.強心ステロイド(ウアバイン)処理でturnoverを完全に阻害された可溶化ATPaseの分子量も、上と同じ蛋白質量範囲で、280,000から192,000へ連続的に変化した。この結果から、ATPの加水分解反応と2プロトマー【→!←】ダイプロトマーの構造的相互変換が直接共役していないことが明らかになった。

1. Soluble [Na^+],[K^+]-ATPase enzyme activity, high performance, high (1)Dissolution buffer:0.3mg/ml [C_(12)][E_(8)],60μg/ml [C_(12)],0.05M NaCl, 0.05M KCl, 1.33mM ATP, 4mM Mg [Cl_2], 1mM EDTA, 10mM HCl-15mM HEPES, ph7.0 (3), flow rate: 0.50ml/min, temperature: 20 ℃. Under the above conditions, 8.6 μg protein solubilized ATPase could be loaded and operated. The results, protein load, and protein content were determined by daily, daily, and weekly dissolution. Determination of Pi in the dissolution solution, determination of ATPase specific activity during dissolution For example, protein content is dependent on protein content, which is 1.94±0.13μ mol Pi/min/mg protein. This activity value is comparable to the specific activity of membrane-bound [Na^+],[K^+]-ATPase, which is 64±4%, and the activity value of insitu. 2. The molecular weight of protein components was determined by light scattering method. As a result, the molecular weight was reduced to 214,000, and the protein content was reduced to 214,000. Protein content below 34.2μg is equal to molecular weight (160,000±3,000). The results above indicate that ATPase activity appears at the minimum structural level, αβ-ATPase activity appears at the minimum structural level, αβ-ATPase activity appears at the minimum structural level. 3. The turnover of the enzyme completely inhibited the molecular weight of the solubilized ATPase, and the protein content of the enzyme ranged from 280,000 to 192,000. The result of ATP hydrolysis reaction is 2.← The structure of the exchange of direct common service between the two sides