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可溶化Na^+,K^+ーATPaseとリン脂質の相互作用

溶解的 Na^+,K^+-ATP 酶与磷脂之间的相互作用

基本信息

批准号：
63580127
负责人：
林雄太郎
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyorin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

可溶化Na^+,K^+ーATPaseを、活性発現に必要な全てのリガンドを含む溶出緩衝液(EB)を用いた高性能ゲルクロマトグラフィーを行い、以下の結果を得た。1.ATPaseの活性化に最適な外因性リン脂質の探索ー種々の精製外因性リン脂質を一定濃度(60μg/ml)でEBに添加したときに、カラム中で再生したATPase活性を比較すると、ホスファチジルセリン(PS、ウシ脳)が、精製膜結合型酵素標品活性の87%、ホスファチジルグリセロール(PG、卵レシチン)が74%、ホスファチジルイノシトール(PI、ウシまたはブタ肝)が47%、ホスファチジルコリン(PC、卵黄)が9.3%、ホスファチジルエタノールアミン(PE、ウシ脳)が0.1%以下であった。酸性リン脂質(PI、PS、PG)間には親和性の差があるが、活性再生作用には本質的な差はないと結論した。一方、PSとPIは、可溶化酵素の構造状態を均一なプロトマー(P)・ダイプロトマー(D)の解離・会合平衡状態にし、PEは不均一な凝集状態にした。従って、「最適なリン脂質」はPSとPIであると結論した。2.P・D間の解離・会合平衡の会合定数(K_a)の測定ー60μg/mlPSを含むEB(4mM ATPを含む)を使って測定した分子量の蛋白質濃度依存曲線から、ATPase活性の発現状態で5.0×10^5M^<-1>、ウアバインで阻害した状態で1.1×10^7M^<-1>の会合定数を得た。ATPもPSも含まない溶出緩衝液では少なくとも1×10^8M^<-1>で、ATPなしでPSだけ添加すると、非常に大きな会合体が出現し、K_aは測定不能であった。リン脂質は酵素蛋白質間の会合を促進し、ATPは会合体の解離を促進した。3.コンホメーション変化とK_aの変化の相関ー可溶化酵素を蛍光標識する条件の検討中である。今後、蛍光強度測定からコンホメーション状態を同定し、それに対応したK_aの変化を測定する。

Dissolved Na^+,K^+-ATPase is essential for its activity development. The following results were obtained using high performance dissolution buffer (EB). 1. The optimum exogenous lipid for ATPase activation and the optimum exogenous lipid for purification were determined at a certain concentration (60μg/ml). The enzyme activity was compared between EB addition and regeneration in the medium. The activity of purified membrane-bound enzyme standard was 87%.(PG, egg) 74%,(PI, egg) 47%,(PC, egg) 9.3%,(PE, egg) 0.1%. There is a difference in affinity between acidic lipids (PI, PS, PG), and a difference in nature between active regeneration. The structure state of the solubilizing enzyme is homogeneous, and the dissociation and convergence equilibrium state of the solubilizing enzyme are heterogeneous. The conclusion is that "the most suitable lipid" is not suitable. 2. Determination of the dissociation/rendezvous equilibrium number (K_a) of P·D-60μg/ml PS with EB(4mM ATP). Determination of the protein concentration-dependent curve of molecular weight. Determination of the confluence number of ATPase activity at the onset state of 5.0×10^5M^and at the inhibition state <-1>of 1.1×10^7M^<-1>. ATP, PS, and the like are dissolved in a buffer solution containing 1× 10^8 M<-1>, ATP, PS, and the like. Lipid and protein binding are promoted, ATP binding is promoted. 3. The conditions for the transformation of K_a and the transformation of K_a are discussed in this paper. In the future, the light intensity measurement will be carried out in the same way as the measurement of K_a.