可溶化Na^+,K^+ーATPaseとリン脂質の相互作用

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可溶化Na^+,K^+ーATPaseを、活性発現に必要な全てのリガンドを含む溶出緩衝液(EB)を用いた高性能ゲルクロマトグラフィーを行い、以下の結果を得た。1.ATPaseの活性化に最適な外因性リン脂質の探索ー種々の精製外因性リン脂質を一定濃度(60μg/ml)でEBに添加したときに、カラム中で再生したATPase活性を比較すると、ホスファチジルセリン(PS、ウシ脳)が、精製膜結合型酵素標品活性の87%、ホスファチジルグリセロール(PG、卵レシチン)が74%、ホスファチジルイノシトール(PI、ウシまたはブタ肝)が47%、ホスファチジルコリン(PC、卵黄)が9.3%、ホスファチジルエタノールアミン(PE、ウシ脳)が0.1%以下であった。酸性リン脂質(PI、PS、PG)間には親和性の差があるが、活性再生作用には本質的な差はないと結論した。一方、PSとPIは、可溶化酵素の構造状態を均一なプロトマー(P)・ダイプロトマー(D)の解離・会合平衡状態にし、PEは不均一な凝集状態にした。従って、「最適なリン脂質」はPSとPIであると結論した。2.P・D間の解離・会合平衡の会合定数(K_a)の測定ー60μg/mlPSを含むEB(4mM ATPを含む)を使って測定した分子量の蛋白質濃度依存曲線から、ATPase活性の発現状態で5.0×10^5M^<-1>、ウアバインで阻害した状態で1.1×10^7M^<-1>の会合定数を得た。ATPもPSも含まない溶出緩衝液では少なくとも1×10^8M^<-1>で、ATPなしでPSだけ添加すると、非常に大きな会合体が出現し、K_aは測定不能であった。リン脂質は酵素蛋白質間の会合を促進し、ATPは会合体の解離を促進した。3.コンホメーション変化とK_aの変化の相関ー可溶化酵素を蛍光標識する条件の検討中である。今後、蛍光強度測定からコンホメーション状態を同定し、それに対応したK_aの変化を測定する。