白血球及び血管内皮細胞に於ける組織因子の発現・制御機構

白细胞和血管内皮细胞组织因子的表达及调控机制

• 批准号: 02671119
• 负责人: 田中 廣
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02671119/
• 关键词: 組織因子; 組織因子cDNA; 組織因子mRNA; RTーPCR; 組織因子の発現

止血・血栓形成に密接に関与している組織因子の発現と制御機構につき分子生物学的手法を導入する事により培養白血病細胞,白血病細胞の組織因子mRNAの発現を検討した。組織因子cDNAの同定:Spicerらにより同定された組織因子cDNAマップと組織因子アミノ酸シ-クエンスに基づき45merのオリゴヌクレオチドを合成し、これをプロ-ブとして市販の30merのプロ-ブと併せて、λgt11を用いた胎盤cDNAライブラリ-よりシグナルペプチド部分およびmature protein部分を含む1.2kbのDNA断片をえた。これを標識してプロ-ブとして用いた。細胞RNA抽出:培養白血病細胞HLー60をエンドトキシンにて経時的に刺激した後,細胞RNAをGTC/CsTFAにて抽出し,poly(A)^+ selectionし,アガロ-スゲル電気泳動後,ノ-ザンハイブリダイゼ-ションを行った。2.2kb付近に組織因子mRNAのバンドが同定され、刺激に応じて次第に濃くなり組織因子mRNA発現の増加をうかがわせた。RTーPCR法による組織因子mRNAの解析:組織因子遺伝子マップより組織因子遺伝子のエクソン1から2にまたがる24塩基を5'側プライマ-、エクソン4内の24塩基を3'側プライマ-として合成した。組織因子遺伝子DNA上は、この2つのプライマ-は7kb以上離れているが、cDNA上では410bp断片が増幅出来る筈である。培養白血病細胞HLー60及び急性白血病症例よりGTC/CsTFA法を用いて抽出した総RNA量1ー2μgを3'プライマ-を用いてcDNA合成を行ったのち、5',3'両プライマ-を用いて30サイクルのPCRを施行した。HLー60では,エンドトキシン添加で経時的に組織因子mRNAの発現増加が認められた。また臨床的にDIC症状のあるM3症例では,骨髄および末梢血白血病細胞に組織因子mRNAの発現増加が認められた。DICの認められなかったM1,M4症例では組織因子mRNAの発現は認められなかった。血管内皮細胞については現在RTーPCR法を用いて組織因子mRNA発現を検討中である。

Hemostasis and thrombosis are closely related to the control mechanism of tissue factor. Molecular biology techniques are introduced to culture leukemia cells, and the tissue factor mRNA of leukemia cells is analyzed. Tissue factor cDNAの同定：Spicerらにより同定されたTissue factor cDNAマップと Tissue factor Amin acid シ-クエンスにbased づき45mer のオリゴヌクレオチドをSynthetic し, これをプロ-ブとして commercially available 30mer のプロ-ブと和せて, λgt11 Use いた placenta cDNA ライブラリ-よりシグナルペプチド partial およびmature The protein part contains a 1.2kb DNA fragment. The これを logo is してプロ-ブとして用いた. Cell RNA extraction: After the stimulation of leukemia cells HLー60をエンドトキシンにて経, the cell RNA was extracted using GTC/CsTFA, poly(A)^+ After the selection, the アガロ-スゲル电気 is swimming, the ノ-ザンハイブリダイゼ-ションを行った. 2.2kb close tissue factor mRNA のバンドが同定され、stimulated に応じて期に thick くなりtissue factor 発appears のincrease plus をうかがわせた. Analysis of tissue factor mRNA using RT-PCR method: Tissue factor gene analysisら2にまたがる24塩组を5'lateral プライマ-, エクソン4内の24塩baseを3' side プライマ-としてsynthetic した. The tissue factor gene was isolated from the DNA, and the 2 つのプライマ-は was isolated from 7kb or more, and the 410bp fragment from the cDNA was amplified. Cultured leukemia cells HLー60 and acute leukemia cases using GTC/CsTFA method and extracting RNA amount of 1-2μgを3 'プライマ-を Use いて cDNA to synthesize を行ったのち, 5',3'両プライマ-を use いて 30 サイクルのPCR を implementation した. HLー60では,エンドトキシンで経When the tissue factor mRNA is added, it is recognized that it is added. There are clinical symptoms of DIC and M3 cases, and the diagnosis of peripheral blood leukemia cells and tissue factor mRNA has increased. The diagnosis of DIC is the same as that of M1 and M4 cases, and the tissue factor mRNA is present. Vascular endothelial cells are now detected by RT-PCR method using tissue factor mRNA.

项目成果

田中 廣: "Analysis of leukemia cell tissue factor by western blotting technique." Thrombos.Haemostas.58. 135 (1987)

Hiroshi Tanaka：“通过蛋白质印迹技术分析白血病细胞组织因子。”Thrombos.Haemostas.58 (1987)。

田中 廣: "Production of tissue factor by leukemia cells." Thrombos.Haemostas.62. 68 (1989)

Hiroshi Tanaka：“白血病细胞产生组织因子。”Thrombos.Haemostas.68 (1989)。

田中 廣: "The leukocyte membrane and its contribution to thrombosis and haemostasisーwith special reterence to tissue fuitor." Acta Haemostol.Jpn.49. 1583-1594 (1986)

Hiroshi Tanaka：“白细胞膜及其对血栓形成和止血的贡献 - 特别涉及组织 fuutor。Jpn.49（1986）。”