脱窒光合成細菌の一酸化窒素(NO)還元酵素の分離精製とその性質

自然界の窒素循環で重要な役割をしている脱窒の機構のうち, 一酸化窒素(NO)還元の機構はほとんど明らかでない. 特にNO還元酵素(NOR)の酵素化学的実体については全くわかっていない. 私達は脱窒光合成細菌Rhodobacter sphaeroides f.s. denitrificansの脱窒の機構を調べてきたが, 今回NORを分離精製することを試みた.光にNORはチトクロームbc1複合体(bc1 complex)上にあると推定される結果を報告したが, 今回Trumpowerらのdodecylmaltosideをdetergentとしてbc1 complexを調整する方法を採用し, NORはbc1 complexとは異なるfraction(Reaction centerを含む)に依存する事が認められた. 脱窒光合成培養したcellからクロマトフォアを調整し, dodecylmaltosideが可溶化後, DEAE Biogel AクロマトグラフィーでNOR fractionとbc1 complex fractionに分離した. 両fractionは更にDEAE Sepharase CL6B, Sepharose 6Bクロマトグラフィーで精製した. NOR活性, Ubiquinol:cytochrome C reductase活性の回収率はそれぞれ7%, 5%であった. NOR fractionにもcyt.b,cは存在しその比は約1:2で, bc1complexのcyt.b,cのcyt.b,cの比は2:1であった.SDSPAGEにより両fractionを構成するペプチドの分析で, bc1 complexは報告の通りcyt.b,c1,FeS protein,13 kDa proteinより構成され, NOR fractionにはFeS protein,13 kDa proteinは無く, cyt.b,c1のバンドとReaction centerのH,M,L subunitと, さらに45kDaと38kDaのバンドが認められた. NOR fractionについてはさらにPhenylsepharose CL4Bの疎水クロマトグラフィーを行うと, NOR活性は3%Tween20または1%Triton X100で溶出され, そのfractionに上記の45kDa, 38kDaのpolypeptideが存在した. 2つのpolypeptideの一方がNORと関係あるものと推定した.

自然界の窒素循環で重要な役割をしている脱窒の機構のうち, 一酸化窒素(NO)還元の機構はほとんど明らかでない. 特にNO還元酵素(NOR)の酵素化学的実体については全くわかっていない. 私達は脱窒光合成細菌Rhodobacter sphaeroides f.s. denitrificansの脱窒の機構を調べてきたが, 今回NORを分離精製することを試みた.光にNORはチトクロームbc1複合体(bc1 complex)上にあると推定される結果を報告したが, 今回Trumpowerらのdodecylmaltosideをdetergentとしてbc1 complexを調整する方法を採用し, NORはbc1 complexとは異なるfraction(Reaction centerを含む)に依存する事が認められた. 脱窒光合成培養したcellからクロマトフォアを調整し, dodecylmaltosideが可溶化後, DEAE Biogel AクロマトグラフィーでNOR fractionとbc1 complex fractionに分離した. 両fractionは更にDEAE Sepharase CL6B, Sepharose 6Bクロマトグラフィーで精製した. NOR活性, Ubiquinol:cytochrome C reductase活性の回収率はそれぞれ7%, 5%であった. NOR fractionにもcyt.b,cは存在しその比は約1:2で, bc1complexのcyt.b,cのcyt.b,cの比は2:1であった.SDSPAGEにより両fractionを構成するペプチドの分析で, bc1 complexは報告の通りcyt.b,c1,FeS protein,13 kDa proteinより構成され, NOR fractionにはFeS protein,13 kDa proteinは無く, cyt.b,c1のバンドとReaction centerのH,M,L subunitと, さらに45kDaと38kDaのバンドが認められた. NOR fractionについてはさらにPhenylsepharose CL4Bの疎水クロマトグラフィーを行うと, NOR活性は3%Tween20または1%Triton X100で溶出され, そのfractionに上記の45kDa, 38kDaのpolypeptideが存在した. 2つのpolypeptideの一方がNORと関係あるものと推定した.