コンリアセチルトランスフェレーズのcDNAクローニングとその遺伝子発現機構の解析

乙酰转移酶的cDNA克隆及其基因表达机制分析

• 批准号: 62571007
• 负责人: 石田 功
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1987
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1987 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-62571007/
• 关键词: コリンアセチル転移酵素; 組換えDNA; 運動ニューロン

我々は最近ウシ脳の線条体よりコリンアセチル転移酵素(ChAT)を部分精製したのちマウスを免疫し, 単クローン抗体を3種樹立することに成功したが, 本年度はこの抗体を用いて以下の研究を進めた.(1)ChAT蛋白質の精製とアミノ酸配列の解析:上記単クローン抗体をセフアローズに結合してイムノアフィニティークロマトグラフィを作成した. ウシ脳の線条体よりChATを部分精製したのちイムノアフィニティカラムに吸着させ, Tris-HCI暖衡液で洗浄後NaClとUreaによってChATを溶出した. この段階でChATはほゞ純品に近い状態であったが, 微量の混入蛋白質を除くためさらにSDS電気泳動により68KDaのChATを分離溶出した. そのアミノ酸配列を決定するためChAT蛋白をトリプシンやリジンエンドペプチターゼで分解し, 逆層液体クロマトグラフィーにより蛋白質断片を分離する条件を検討中である.(2)ChATのcDNAクローニング:我々が作成した単クローン抗体SDSで変性したChATを認識するので, この抗体を用いてcDNAクローニングを行っている. すなわち, ウシ脊髄前角のPoly(A)^+RNAより二重鎖cDNAを調整し, これを発現ベクターλgtll11に組み込んだのちcDNAライブラリーを作成し, 単クローン抗体でスクリーニングした. その結果7個の陽性クローンを得たがこのうち3クローンは免疫反応が強くお互いに交叉すること, またノーザンブロットでは脳と脊髄に特異的であることから, ChATのcDNAの可能性が大きいと考えられる. このクローンについて制限酵素マップを作成し, 塩基配列も一部決定した. (1)の結果と合わせてこれがChATのcDNAであるかどうかが明らかになるであろう.

Recently, we have successfully established three kinds of antibodies against the virus by partially refining its molecular structure and enzyme (ChAT). This year, we have made progress in the following research on the use of these antibodies. (1) Purification of ChAT protein and analysis of its acid sequence: preparation of ChAT protein by binding to ChAT protein. ChAT is partially refined and purified by Tris-HCI warm equilibrium solution. ChAT was isolated from the pure sample by SDS electrophoresis. The conditions for the separation of ChAT protein fragments were discussed. (2) cDNA cloning of ChAT: We have learned about the variability of ChAT when making the monoclonal antibody SDS, and we can use this antibody to perform cDNA cloning. Poly(A)^+RNA cDNA The results showed that 7 of the positive genes were found to be related to each other, and the possibility of ChAT cDNA was high. A part of the base alignment is determined by the preparation of the restriction enzyme. (1)The results are as follows: ChAT cDNA.