ウシ歯髄細胞培養中に発現されるコラゲナーゼインヒビターの遺伝子の研究

1.実験方法(1)ウシ末萌出歯髄細胞を、10%FBSを含むMEM倍地で、5×10^7個まで増殖し、これを無血清倍地に換え50時間後に細胞を集めた。(2)RNAの抽出はグアニジン酸ホットフェノール法、mRNAは、オリゴdTセルロースを用いて精製した。(3)アマシャム社の合成システムによりmRNAよりcDNAを合成した。(4)cDNAは入gt10と入gt11にクローニングし、それぞれE.COli L514とE.coli Y1090に感染させた。(5)ライブラリーノスクリニングはコラゲナーゼインヒビターのモノクロナール抗体ならびに合成DNAプローブで行なった。2.実験結果(1)6×10^6pfuの入gt11cDNAライブラリーが得られ組換率は98.5%と良い結果が得られた。コラゲナーゼインヒビター(C.I)のモノクロナール抗体によるスクリーニングは、2×10^3pfu/plateを50枚行なったが陽性のブラークは得られなかった。(2)6×10^5pfuの入gt10cDNAライブラリーが得られ、組換率は78%であった。これをN末端アミノ酸より推定合成した25塩基のDNAプローブで、2×10^3pfu/plate 50枚スクリーニングした所、3プレートに1つの割合で陽性プラークを得た。しかしこれを再プレートしても陽性プラークが増加しなかった。3.考察ならびに今後の計画C.I.のcDNAを組み込んだクローンを得ることができなかった原因として(1)mRNAが取れていない。(2)cDNAの合成がうまくいっていない。(3)材料が不適当(4)スクリーニングに用いた抗体や合成プローブが不適当など考えられる。これらの点を検討し再度実験を行う予定。

1.実験方法(1)ウシ末萌出歯髄細胞を、10%FBSを含むMEM倍地で、5×10^7個まで増殖し、これを無血清倍地に換え50時間後に細胞を集めた。(2)RNAの抽出はグアニジン酸ホットフェノール法、mRNAは、オリゴdTセルロースを用いて精製した。(3)アマシャム社の合成システムによりmRNAよりcDNAを合成した。(4)cDNAは入gt10と入gt11にクローニングし、それぞれE.COli L514とE.coli Y1090に感染させた。(5)ライブラリーノスクリニングはコラゲナーゼインヒビターのモノクロナール抗体ならびに合成DNAプローブで行なった。2.実験結果(1)6×10^6pfuの入gt11cDNAライブラリーが得られ組換率は98.5%と良い結果が得られた。コラゲナーゼインヒビター(C.I)のモノクロナール抗体によるスクリーニングは、2×10^3pfu/plateを50枚行なったが陽性のブラークは得られなかった。(2)6×10^5pfuの入gt10cDNAライブラリーが得られ、組換率は78%であった。これをN末端アミノ酸より推定合成した25塩基のDNAプローブで、2×10^3pfu/plate 50枚スクリーニングした所、3プレートに1つの割合で陽性プラークを得た。しかしこれを再プレートしても陽性プラークが増加しなかった。3.考察ならびに今後の計画C.I.のcDNAを組み込んだクローンを得ることができなかった原因として(1)mRNAが取れていない。(2)cDNAの合成がうまくいっていない。(3)材料が不適当(4)スクリーニングに用いた抗体や合成プローブが不適当など考えられる。これらの点を検討し再度実験を行う予定。