ウシ歯髄細胞培養中に発現されるコラゲナーゼインヒビターの遺伝子の研究

牛牙髓细胞培养物中胶原酶抑制剂基因表达的研究

• 批准号: 63570882
• 负责人: 深澤 加與子
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Matsumoto Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63570882/
• 关键词: コラゲナーゼインヒビター; ウシ歯髄細胞; cDNAライブラリー

1.実験方法(1)ウシ末萌出歯髄細胞を、10%FBSを含むMEM倍地で、5×10^7個まで増殖し、これを無血清倍地に換え50時間後に細胞を集めた。(2)RNAの抽出はグアニジン酸ホットフェノール法、mRNAは、オリゴdTセルロースを用いて精製した。(3)アマシャム社の合成システムによりmRNAよりcDNAを合成した。(4)cDNAは入gt10と入gt11にクローニングし、それぞれE.COli L514とE.coli Y1090に感染させた。(5)ライブラリーノスクリニングはコラゲナーゼインヒビターのモノクロナール抗体ならびに合成DNAプローブで行なった。2.実験結果(1)6×10^6pfuの入gt11cDNAライブラリーが得られ組換率は98.5%と良い結果が得られた。コラゲナーゼインヒビター(C.I)のモノクロナール抗体によるスクリーニングは、2×10^3pfu/plateを50枚行なったが陽性のブラークは得られなかった。(2)6×10^5pfuの入gt10cDNAライブラリーが得られ、組換率は78%であった。これをN末端アミノ酸より推定合成した25塩基のDNAプローブで、2×10^3pfu/plate 50枚スクリーニングした所、3プレートに1つの割合で陽性プラークを得た。しかしこれを再プレートしても陽性プラークが増加しなかった。3.考察ならびに今後の計画C.I.のcDNAを組み込んだクローンを得ることができなかった原因として(1)mRNAが取れていない。(2)cDNAの合成がうまくいっていない。(3)材料が不適当(4)スクリーニングに用いた抗体や合成プローブが不適当など考えられる。これらの点を検討し再度実験を行う予定。

1. Method (1) After germination of cells, 10% FBS containing MEM was used for multiplication, 5 × 10^7 cells were multiplied, and cells were collected after 50 time of serum-free multiplication. (2) RNA extraction method, RNA extraction method, mRNA extraction method, and RNA purification method. (3) AMATIC CO., LTD.'s Synthetic Synthetic Synthetic Synthetic Synthetic Synthetic Synthesis of mRNA and cDNA. (4) cDNA は enter gt10 and と enter gt11 にクローニングし, それぞれE.COli L514 and E.coli Y1090 infect させた. (5)ライブラリーノスクリニングはコラゲナーインヒビターのモノクロナールantibodyならびにsynthetic DNAプローブで行なった. 2. Results (1) The exchange rate of 6×10^6pfu into gt11cDNA was 98.5%, and the result was good.コラゲナーゼインヒビター(C.I)のモノクロナールantibody によるスクリーニングは, 2×10^3pfu/plateを50 pieces of なったがpositive のブラークは得られなかった. (2) 6×10^5pfu was injected into gt10cDNA, and the group exchange rate was 78%.これをN-terminal amino acid より presumed synthesis of した25-yl のDNA プローブで, 2×10^3pfu/plate 50 pieces of スクリーニングした, 3 pieces of プレートに1つの合でpositive プラークをget.しかしこれをプレートしてもpositive プラークが Increase plus しなかった. 3. Examine the future plans of the C.I. cDNA teamをget ることができなかったcause として(1)mRNAがtake れていない. (2) Synthesis of cDNA. (3) The material is not suitable. (4) The スクリーニングに uses the いたantibody to synthesize the プローブが is not suitable and the など卡えられる is used.これらの点を検问し 実験を行うdetermined.