ウシ歯髄細胞培養中に発現されるコラゲナ-ゼインヒビタ-の遺伝子の研究

1.実験方法(1)培養条件の検討:ウシ末萌出歯髄細胞を10%FBSを含むMEM培地で増殖レコンフルエントした後、(A)-FBS/MEM)(B)12-O-Tetradecanoyl-Phorbol-13Acetaye(TPA)60ng/mlを含むMEM培地に換え、培地中のコラゲナ-ゼインヒビタ-(C.I.)量を抗原抗体反応で測定する。(2)TPA含有培地で培養した細胞のmRNAを抽出し、cDNAライブラリ-(λgtll)を作る。(3)C.I.ポリクロナ-ル抗血清でライブラリ-をスクリ-ニングし、クロ-ンを取り出し、挿入されたDNAのサイズの測定ならびにDNAの精製。またタンパク質を発現させ、ライセ-トの性質を同定した。(4)ダイデオキシチェ-ン法により塩基配列を決定し、ヒトC.I.cDNAの塩基配列との比較をする。2.結果(1)TPA処理により高発現条件下でcDNAライブラリ-を作成できた。(2)ポリクロナ-ル抗血清によるスクリニングで、10^3個に数個の陽性プラ-クを得た。(3)10種のクロ-ンを取り出した。挿入DNAサイズは400〜1100塩基であった。タンパク発現ライセ-トはどのクロ-ンもC.I.活性を示さずモノクロナ-ル抗体とも反応はしなかった。(4)塩基配列の決定によりクロ-ン間に相同性が無かったが、ヒトC.I.cDNAの塩基配列との比較により、1つのクロ-ンがC末端側アミノ酸90をコ-ドする塩基配列を含むと予想された。3.考察ならびに今後の計画cDNAの1部を含むクロ-ンDANをプロ-ブとして、ライブラリ-をスクリニングし、全cDANを含むクロ-ンを取り出す。

1.実験方法(1)培養条件の検討:ウシ末萌出歯髄細胞を10%FBSを含むMEM培地で増殖レコンフルエントした後、(A)-FBS/MEM)(B)12-O-Tetradecanoyl-Phorbol-13Acetaye(TPA)60ng/mlを含むMEM培地に換え、培地中のコラゲナ-ゼインヒビタ-(C.I.)量を抗原抗体反応で測定する。(2)TPA含有培地で培養した細胞のmRNAを抽出し、cDNAライブラリ-(λgtll)を作る。(3)C.I.ポリクロナ-ル抗血清でライブラリ-をスクリ-ニングし、クロ-ンを取り出し、挿入されたDNAのサイズの測定ならびにDNAの精製。またタンパク質を発現させ、ライセ-トの性質を同定した。(4)ダイデオキシチェ-ン法により塩基配列を決定し、ヒトC.I.cDNAの塩基配列との比較をする。2.結果(1)TPA処理により高発現条件下でcDNAライブラリ-を作成できた。(2)ポリクロナ-ル抗血清によるスクリニングで、10^3個に数個の陽性プラ-クを得た。(3)10種のクロ-ンを取り出した。挿入DNAサイズは400〜1100塩基であった。タンパク発現ライセ-トはどのクロ-ンもC.I.活性を示さずモノクロナ-ル抗体とも反応はしなかった。(4)塩基配列の決定によりクロ-ン間に相同性が無かったが、ヒトC.I.cDNAの塩基配列との比較により、1つのクロ-ンがC末端側アミノ酸90をコ-ドする塩基配列を含むと予想された。3.考察ならびに今後の計画cDNAの1部を含むクロ-ンDANをプロ-ブとして、ライブラリ-をスクリニングし、全cDANを含むクロ-ンを取り出す。