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ラムダファ-ジベクタ-を用いたバゾプレッシンV_2受容体のcDNAクロ-ニング

使用 lambda 噬菌体载体 cDNA 克隆加压素 V_2 受体

基本信息

批准号：
01570094
负责人：
木村康志
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01570094/
关键词：
バゾプレッシンバゾプレッシンV_2受容体 cDNAクロ-ニング

项目摘要

アセチルコリン受容体、アドレナリン受容体等種々の受容体についてcDNAクロ-ニング,一次構造の決定が行われているが、バゾプレッシンV_2受容体については蛋白質精製の困難及び高感度バイオアッセイ法が、なかった等の問題があり、未だ成功したとの報告はない。本報告者は、ラムダファ-ジベクタ-(λZΔPII)に腎臓由来の培養細胞のmRNAからのcDNAを組込んで、このファ-ジライブラリ-からバゾプレッシンV_2受容体cDNAを持ったファ-ジのクロ-ニングに成功した。腎臓由来のLLC-PK_1培養細胞からmRNAを抽出し,蔗糖密度勾配遠心分離でバゾプレッシンV_2受容体mRNAに富む18sの分画を精製する。これを鋳型としてGubler-Hoffmanの方法によって、cDNAを合成し、両端にECORI部位を持つアダプタ-を結合させ、ラムダファ-ジベクタ-中のECORI部位に組込んで、in vitroパッケ-ジング後、ホスト大腸菌XL-1に感染させて42万個のプラ-クを得た。これを30等分して各群からのファ-ジDNAを抽出し、in vitroでmRNA活性のあるRNAを転写合成し、アフリカツメガエル卵母細胞に微量注入した。4日後、卵母細胞膜中に発現したバゾプレッシンV_2受容体を高感度のアデニル酸シクラ-ゼ活性測定法によって検出した所、3群に陽性が出た。この内、最も反応の強い群のファ-ジをさらに10分割して、各サブグル-プにおいて同様のアッセイを行うことを5回繰返し、単一のファ-ジクロ-ンを得た。現在、ジデオキシ法によりバゾプレッシンV_2受容体cDNAの核酸配列を決定中である。

A report on the determination of the primary structure of the receptor, such as the receptor, the receptor, etc., is presented, which shows that it is difficult to purify the protein and that it is too sensitive to high sensitivity. The present report is a successful attempt to construct cDNA for mRNA expression in cultured cells derived from kidney and to construct cDNA for receptor V_2. mRNA was extracted from LLC-PK_1 cultured cells derived from kidney and purified by sucrose density matching with remote isolation of mRNA from V_2 receptor. The Gubler-Hoffman method was used to synthesize cDNA, to combine the EcoRI sites at the end, to organize the EcoRI sites in the genome, to infect 420,000 E. coli XL-1 in vitro. DNA extraction, RNA synthesis, mRNA activity, microinjection into oocytes from each group were performed in 30 aliquots. After 4 days, oocyte membrane was detected in the oocyte, and the positive cells were detected in the group 3 of V_2 receptor. In this case, the most powerful group of people is divided into 10 groups, each group is divided into 5 groups, and the same group of people is divided into 5 groups. Now, the nucleotide sequence of V_2 receptor cDNA is determined by the method of DNA sequencing.