バゾプレッシンV_2受容体のcDNAクロ-ニングと遺伝子構造解析

加压素V_2受体cDNA克隆及基因结构分析

• 批准号: 02807019
• 负责人: 木村 康志
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02807019/
• 关键词: バゾプレッシンV_2受容体; cDNAクロ-ニング; アフリカツメガエル卵母細胞; LLCーPK1培養細胞

アセチルコリン受容体、アドレナリンβ受容体等の受容体についてcDNAクロ-ニング、一次構造の決定が行われているが、バゾプレッシンV_2受容体については受容体蛋白質精製の因難および高感度バイオアッセイの欠如等の問題があり未だ誰も成功していない。我々は腎臓由来でバゾプレッシンV_2受容体を持つLLCーPK1培養細胞3×10^8個からmRNA5.2mgを抽出精製し、さらにこれを蔗糖密度勾配超遠心分離法で分画した中から最も活性の高い分画41μgを鋳型として逆転写酵素でcDNAを合成し、これをラムダザップIIファ-ジベクタ-に組込み、in vitroパッケ-ジングで4.2×10^5プラ-クのラムダファ-ジcDNAライブラリ-を得た。このライブラリ-を30等分し、各群の1、4×10^4プラ-クからのファ-ジDNAを抽出精製する,このDNAからT_7RNAポリメラ-ゼでキャップ構造を持ちmRNA活性を有するRNAを転写合成し、これをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、バゾプレッシンV_2受容体を発現させた。高感度のV_2受容体バイオアッセイ法により陽性プラ-ク群と検出した。検出されたプラ-ク群をさらに10等分して増殖させ、ファ-ジDNAを抽出して同様の操作を繰返し、5回の操作でV_2受容体のcDNAクロ-ンに到達せんとしたが、カエル卵母細胞に内因性のV_2受容体様活性が冬期に入って出現してきたため未だ目的を果せないでいる。春から秋にかけての時期に再度クロ-ニングを試みる予定である。

ア セ チ ル コ リ ン let body, ア ド レ ナ リ ン beta by let body etc. の is let body に つ い て cDNA ク ロ - ニ ン グ, a structure line の decided が わ れ て い る が, バ ゾ プ レ ッ シ ン V_2 by let body に つ い て は by refining capacity body protein の difficulty お よ び Gao Gan degrees バ イ オ ア ッ セ イ の owe の problem such as such as が あ り who not だ も successful し て い な い . I 々 は routine renal origin で バ ゾ プ レ ッ シ ン V_2 by let body を hold つ LLC ー railway culture cell 3 x 10 ^ 8 か ら mRNA5.2 mg を out refined し, さ ら に こ れ を with vast heart actually sucrose density separation で points draw し た in か ら も most active の い points higher draw 41 mu g を type where と し て inverse planning write enzyme で cDNA を synthetic し, こ れ を ラ ム ダ ザ ッ プ II フ ァ - ジ ベ ク タ - に group 込 み, the in vitro パ ッ ケ - ジ ン グ で 4.2 * 10 ^ 5 プ ラ ク - の ラ ム ダ フ ァ - ジ cDNA ラ イ ブ ラ リ - を た. こ の ラ イ ブ ラ リ - を し 30 divisions, each group of 1, 4 x 10 ^ 4 プ の ラ ク - か ら の フ ァ - ジ を DNA extraction of refined す る, こ の DNA か ら T_7RNA ポ リ メ ラ - ゼ で キ ャ ッ プ tectonic を hold ち mRNA activity を す る RNA を planning write synthetic し, こ れ を ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル oocytes に injection し, バ ゾ Youdaoplaceholder0 を V_2 acceptor を occurs させた. The high-sensitivity <s:1> V_2 acceptor バ <s:1> アッセ アッセ アッセ method によ <s:1> positive プラ- <s:1> group と検 out of た た. 検 out さ れ た プ ラ ク group - を さ ら に ten し て raised colonization さ せ, フ ァ - ジ を DNA extraction し て with others の operation を Qiao return し, 5 back の operation で V_2 by let body の cDNA ク ロ - ン に reach せ ん と し た が, カ エ ル oocytes に endogenous の V_2 let others body active が winter period に into っ て in し て き た た め だ purpose を fruit Youdaoplaceholder0 せな で で る る. Spring か ら autumn に か け て に の period again ク ロ - ニ ン グ を try み る designated で あ る.

项目成果

Koji Kimura: "Expression of vasopressin V_2 receptor in Xenopus laevis oocytes by porcine kidney cell line(LLCーPK1)messenger RNA" Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 174. 149-155 (1991)

Koji Kimura：“猪肾细胞系 (LLC-PK1) 信使 RNA 在非洲爪蟾卵母细胞中表达加压素 V_2 受体”生物化学和生物物理研究通讯。 174. 149-155 (1991)