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バゾプレッシンV_2受容体のcDNAクロ-ニングと遺伝子構造解析

加压素V_2受体cDNA克隆及基因结构分析

基本信息

批准号：
02807019
负责人：
木村康志
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アセチルコリン受容体、アドレナリンβ受容体等の受容体についてcDNAクロ-ニング、一次構造の決定が行われているが、バゾプレッシンV_2受容体については受容体蛋白質精製の因難および高感度バイオアッセイの欠如等の問題があり未だ誰も成功していない。我々は腎臓由来でバゾプレッシンV_2受容体を持つLLCーPK1培養細胞3×10^8個からmRNA5.2mgを抽出精製し、さらにこれを蔗糖密度勾配超遠心分離法で分画した中から最も活性の高い分画41μgを鋳型として逆転写酵素でcDNAを合成し、これをラムダザップIIファ-ジベクタ-に組込み、in vitroパッケ-ジングで4.2×10^5プラ-クのラムダファ-ジcDNAライブラリ-を得た。このライブラリ-を30等分し、各群の1、4×10^4プラ-クからのファ-ジDNAを抽出精製する,このDNAからT_7RNAポリメラ-ゼでキャップ構造を持ちmRNA活性を有するRNAを転写合成し、これをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、バゾプレッシンV_2受容体を発現させた。高感度のV_2受容体バイオアッセイ法により陽性プラ-ク群と検出した。検出されたプラ-ク群をさらに10等分して増殖させ、ファ-ジDNAを抽出して同様の操作を繰返し、5回の操作でV_2受容体のcDNAクロ-ンに到達せんとしたが、カエル卵母細胞に内因性のV_2受容体様活性が冬期に入って出現してきたため未だ目的を果せないでいる。春から秋にかけての時期に再度クロ-ニングを試みる予定である。

The problems of the preparation of the protein in the receptor, such as the receptor, the receptor, etc., such as the cDNA library, the determination of the primary structure, the difficulty of purification of the receptor protein, the high sensitivity of the receptor protein, etc., have not been solved. The origin of the protein was determined by the method of reverse transcription of enzyme cDNA. The protein was extracted from cultured cells of LLC PK1. The mRNA was purified by sucrose density matching with ultra-telecentric separation method. The protein was synthesized by reverse transcription of enzyme cDNA. in vitro The DNA was extracted and purified from each of the 1,4 × 10^4 groups, and the T_7 RNA was isolated and purified from each of the 1,4 × 10^4 groups, and the RNA was synthesized from each of the 1,4 × 10^4 groups, and the mRNA activity was maintained. High sensitivity V_2 receptor is the most sensitive type. The cDNA library of V_2 receptor was isolated from oocytes in 10 cycles, and the activity of endogenous V_2 receptor in oocytes was detected in 5 cycles. Spring and autumn are the times when the sun rises again.