Study on the phosphatidylcholine-synthetic enzyme genes in mammalian cells

哺乳动物细胞磷脂酰胆碱合成酶基因的研究

基本信息

  • 批准号:
    01570123
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.34万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
  • 财政年份:
    1989
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1989 至 1990
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

In the present study we tried to isolate the CKI and PEM genes encoding choline kinase and phosphatidylethanolamine-N-methyltransferase from mammalian cells. Firstly, hybridized radioactively labeled segments of the yeast-CKI and PEM2 genes to plaques of a pharge cDNA library of rat liver. Although we performed several experiments with changing the hybridization conditions, we could not get the genes by this method. Secondly, a rat liver cDNA library was constructed in a yeast expression vector and used to isolate genes that can function in yeast to suppress the grouth defect of the cki or pem2 mutation. But no positive clone was obtained by this method, too. Therefore we investigated the reason why this system could not work. We found that the avearage size of the cDNA insert was about 500 base pair and was insufficient to encode the enzymes. Thirdly, we decided to use the high-frequency transformation method for cloning mammalian cDNAs by trans-complementation of Shizosaccharomyces pombe which was developed by Okazaki and Okayama. A human liver cDNA library was donated by professor Okayama, Osaka University. Next the tow strains SPC1 and SPC2 were isolated as choline auxotroph from the wild-type strain by the use of of ethyl methanesulfonate mutagenesis. The strain SPC2 was identified as a pem2 mutant by the analysis of the phospholipid intermediates and by assaying the methyltrasferase. Thus we have been just ready for cloning the mammalian genes by this method. On the other hand we used a yeast Saccharomyces cerevisiae as a model system for the study on mammalian phospholipid synthesis. Comparison of the 5'boundary reguratoary regions pf PEM1 and PEM2 genes encoding the enzymes of phosphatidylethanolamine methylation pathway revealed the presence of a commmon octameric sequence, 5'-CATRTGAA-3'. The sequence was concluded to play an important role in the myo-inositol-choline regulation of PEM1 and PEM2.
在本研究中,我们试图从哺乳动物细胞中分离编码胆碱激酶和磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶的CKI和PEM基因。首先,将放射性标记的酵母CKI和PEM 2基因片段与大鼠肝脏噬菌斑cDNA文库杂交。虽然我们进行了多次实验,改变杂交条件,我们不能得到的基因通过这种方法。其次,在酵母表达载体中构建了大鼠肝脏cDNA文库,并用于分离在酵母中能够抑制cki或pem 2突变的生长缺陷的基因。但该方法也未获得阳性克隆。因此,我们调查了这个系统无法工作的原因。我们发现该cDNA插入片段的平均大小约为500个碱基对,不足以编码这些酶。第三,我们决定使用高频转化法,通过冈崎和冈山开发的粟酒裂殖酵母的反式互补来克隆哺乳动物cDNA。人肝cDNA文库由大坂大学冈山教授捐赠。然后,通过甲基磺酸乙酯诱变,从野生型菌株中分离到两株胆碱营养缺陷型菌株SPC 1和SPC 2。通过对磷脂中间体的分析和甲基转移酶的测定,将菌株SPC 2鉴定为pem 2突变体。因此,我们已经为用这种方法克隆哺乳动物基因做好了准备。另一方面,我们利用酿酒酵母作为哺乳动物磷脂合成研究的模型系统。比较PEM 1和PEM 2编码磷脂酰乙醇胺甲基化途径的酶的5 '端边界调控区,发现存在一个共同的八聚体序列5'-CATRTGAA-3 '。该序列被认为在PEM 1和PEM 2的肌醇-胆碱调节中起重要作用。

项目成果

期刊论文数量(9)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
保坂 公平・小瀧努: "酵母のリン脂質生合成系酵素の発現調節:イノシト-ルとコリンによる協調的抑制" 生化学. 62. 451-456 (1990)
Kohei Hosaka 和 Tsutomu Kotaki:“酵母磷脂生物合成酶表达的调节:肌醇和胆碱的协同抑制”生物化学 62. 451-456 (1990)。
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Junーichi Nikawa: "Primary Structwe of the Yeast Choline Transport Gene and Regulation of 1ts Expression" J.Biol.Chem. 265. 15996-16003 (1990)
Junichi Nikawa:“酵母胆碱转运基因的主要结构和 1ts 表达的调节”J.Biol.Chem. 265. 15996-16003 (1990)
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  • 影响因子:
    0
  • 作者:
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Tsutom Kodaki,Kohei Hosaka,Junーichi Nikawa and Satoshi Yamashita: "Identification of the Upstream Activation Soquences Responsible for the Expression and Regulation of the PEMI and PEM2 Genes Encoding the Enztnes of the Phosphatzdyle thonolamine Methylati
Tsutom Kodaki、Kohei Hosaka、Junichi Nikawa 和 Satoshi Yamashita:“鉴定负责编码磷酸酯乙醇胺甲基化酶的 PEMI 和 PEM2 基因表达和调节的上游激活序列”
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    0
  • 作者:
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Yuko Tsukagoshi: "Expression of the CCT・Gene Encoding Cholinephosphate Cytidylyltransferase of Sachaiomyes ceuvisea in Endaidhid aoli" J.Balteiol.(1991)
Yuko Tsukagoshi:“Endaidhid aoli 中 Sachaiomyes ceuvisea 的 CCT·编码胆碱磷酸胞苷酰基转移酶的基因的表达”J.Balteiol.(1991)
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Yuko Tsukagoshi,Junーichi Nikawa,Kohei Hosaka and Satoshi Yamashita: "Expression of the CCT Gene Encoding Choline phosphate Cytidylyltransferoee of Saccharomyos cereviszae in Escherichres coli" J.Baeteriol.(1991)
Yuko Tsukagoshi、Junichi Nikawa、Kohei Hosaka 和 Satoshi Yamashita:“编码酿酒酵母磷酸胆碱胞苷酰转移酶的 CCT 基因在大肠杆菌中的表达”J. Baeteriol。
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