病理切片中における寄生虫体同定法の改良(DNAポリメラ-ゼ増殖法の応用)

病理切片寄生虫鉴定方法的改进（DNA聚合酶扩增法的应用）

• 批准号: 02807043
• 负责人: 村主 節雄
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Kagawa Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02807043/
• 关键词: 寄生虫体の新同定法; 種特異微量DNA; PCR法による増幅

Polymerase chain reaction(PCR)によれば、pgオ-ダ-のDNAを数時間内にμgに増幅させることが可能である。このmethodの増幅能の高さを利用して病理切片中の微量DNAから寄生虫体の種特異DNAを探り出し、種の同定を行う方法の確立を試みた。反応液の組成はdATP,dCTP,dGTP,dTTPを各200μM,Taq polymerase 1 unit,20mM TrisーHCl系 buffer(pH8.8),正逆方向性プライマ-、及び破検切片中の犬糸状虫、及び豚蛔虫成虫体より抽出したDNA(1ng程度)でおこなった。DNAの抽出は材料を液体窒素中で粉砕後、TrisーHCl(pH8.0),EDTA,NaCl,SDS,proteinaseKを加え65℃にて2時間処理し、フェノ-ル/クロロホルムにて除タンパクした後、エタノ-ル沈澱を行い、TEバッファ-に溶解後、260nmの吸光度により、DNA量を測定した。一方、病理切片の場合はバラフィン包理切片(厚さ10μmを2〜3枚)をキシレンにて脱パラフィン後、エタノ-ル処理をし、以下同様の抽出を行った。現段階における結果は、PCR産物からアガロ-ス電気泳動による数本のDNAバンドが得られるものの、バンドの明瞭さ、種間差異、バックグランドの強弱などプライマ-の適否により大きく左右されている。従って現在、数種のプライマ-を作製し、それらの内から種の指標となるべき最高のプライマ-を現在選出中である。また、PCR増幅の基本反応は1)二本鎖DNAの一本鎖化、2)プライマ-の相補的対合、3)新DNA鎖の合成の三ステップから成っている。現在、基本的には各ステップを1)94℃,1分処理、2)37℃,2分、3)72℃,3分で行っているが、それぞれのプライマ-にマッチする条件を詳しく検討中である。

Polymerase chain reaction (PCR) is possible, and pgオ-ダ-のDNA can be used to increase the amplitude of μg within a few seconds. The method is to increase the amplitude of the parasite and to exploit the trace amounts of DNA in the pathological sections, to detect the species-specific DNA of the parasite, and to establish and test the species. The composition of the reaction solution is: 200μM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, Taq polymerase 1 unit, 20mM Tris-HCl system Buffer (pH8.8), forward and reverse directional プライマ-, and のcanine worm in slices, and the adult body of Ascaris ascaris were extracted したDNA (about 1ng) and でおこなった. The DNA extraction materials were mixed with powder in liquid buffer, and Tris-HCl (pH 8.0), EDTA, NaCl, SDS, and proteinase K were added at 65°C for 2 hours. After processing the し、フェノ-ル/クロロホルムにて except the タンパクした, the エタノ-ル precipitated を row After dissolving TE バッファ-に, the absorbance at 260nm was measured, and the amount of DNA was measured. On the one hand, in the case of pathological slices, はバラフィン slices (thickness: 10 μm, 2 to 3 pieces) are available. After the シレンにて takes off the パラフィン, the エタノ-ル handles the をし, the following is the same as the 様のdrawing を行った. At this stage, the results of PCR products are as follows: , バンドの明さ, interspecies differences, バックグランドのStrength and Weakness などプライマ-のAdaptability により大きくaround されている.従ってNow, several types of のプライマ-をproductionし, それらの内からkindのindexとなるべきhighest のプライマ-をNow select the middle である.また、The basic reaction of PCR amplification is 1) the locking of two DNA locks, 2) the complementary combination of DNA locks, 3) the synthesis of new DNA locks and the three-step locking process. Now, the basic にはステップを1) 94℃, 1 minute processing, 2) 37℃, 2 minutes, 3) 72℃ , 3 points of で行っているが, それぞれのプライマ-にマッチするconditionsを detailしく検検曧ある.

项目成果

Chubun Sato: "Identification of human blood in mosquitoes (Diptera:Culicidae) using nonーradioactive dot blot hybridization." Journal of Medical Entomology.

Chubun Sato：“利用非放射性斑点杂交技术鉴定蚊子（双翅目：蚊科）的人类血液。”